微生物遗传变异和育种.ppt

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1、第八章 微生物遗传与变异,表型饰变：,表型的差异只与环境有关 特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 （自发突变频率通常为10-6-10-9）,基因是生物体内具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。 基因组是指存在于细胞或病毒中的所有基因。由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。,第二节

2、微生物的基因组结构,原核生物基因的特点,遗传信息的连续性 功能相关的结构基因组成操纵子结构 结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝 基因组的重复序列少而短,真核生物的基因的特点,基因的不连续性：内含子、外显子。 转录和转译在细胞中有空间分隔 。 高度拷贝和重复顺序 ：遗传丰余 (genetic redundancy) 。,2、单细胞真核微生物啤酒酵母基因组,质粒：游离于原核生物基因组以外，具有独立复制能力的细胞质遗传因子，存在于各种微生物细胞中。 转座子：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。,第二节 质粒和转座因子,质粒和转座因子都是细胞中除染色体以

3、外的遗传因子。,致育因子（F质粒）： 大肠杆菌等部分细菌内存在，决定其性别并具有转移能力的质粒。（F+，F-，Hfr，F） 抗性因子（R质粒）： 表现为抗药性和抗重金属两类。 Col质粒： 细菌素：部分细菌由质粒编码的蛋白质产生的能抑制或杀死其他近源细菌的代谢产物。,用于“残害手足”,根据质粒编码的功能和赋予宿主的表型效应分类:,毒性质粒： 质粒具有编码毒素的基因，引起致病菌的致病性。 Ti质粒：诱癌质粒，导致植物产生根癌，膨大等现象；用于植物基因工程。 Ri质粒：发根质粒，诱发双子叶植物患毛根瘤，大量称为毛状根的不定根。,月季根癌,代谢质粒 质粒上携带有降解某些基质的酶的基因。 仅在假单胞菌

4、（Pseudomonas）中发现。具有降解复杂有毒化合物的能力。“超级菌”。,它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体 （一般加上抗性基因）,隐秘质粒 隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。,第四节 基因突变和修复,基因突变：基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，泛指遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。,一、基因突变的类型及其分离,碱基变化类型：同义突变、错义突变、 无义突变、移码突变 突变株的表型变化： 营

5、养缺陷型 微生物遗传学中重要的选择标记和育种手段。,hisC-和hisC+,影印法分离营养缺陷型, 抗药性突变型,strr 和 ampr, 条件致死突变型 常用的条件致死突变是温度敏感突变，用 ts 表示。, 形态突变型 细胞和菌落形态、颜色、噬菌斑等 DNA重组技术中的蓝白筛选。, 产量突变型,1.自发性,2.不对应性,细胞可自发的产生突变,突变性状与引起突变的原因间无直接对应关系,3.稀有性,突变几率为10-610-9,5.独立性,4.规律性,诱变剂的使用可大大提高突变几率,6.可诱变性,7.遗传和可逆性,正向突变/回复突变,二、基因突变的分子基础,分子基础,由腺嘌呤碱基互变异构导致的自发

6、突变 （）,DNA聚合酶产生的错误、DNA物理损伤、重组和转座等。 转换、颠换 RNA基因组的突变： RNA复制酶 RNA修复机制,诱发突变 通过物理、化学和生物因子能够提高其突变频率，这一类物质称为诱变剂。 常用的诱变剂： 碱基类似物：碱基错配 插入染料 ： 移码突变 直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂： EMS、DES、NTG 辐射和热：置换突变、SOS错误倾向修复 生物诱变因子： 转座子,Ames实验 诱变剂与致癌物质,“生物化学统一性”法则：,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,美国

7、加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明， 因此称为Ames试验,检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。,Ames试验,潜在的某种化学诱变剂使得回复突变作用增强,UV导致遗传物质产生嘧啶二聚体（TT、TC、CC），造成局部DNA分子无法配对，引起微生物的死亡或突变。 一般微生物具有光复活作用：光解酶Phr 在利用UV进行诱变育种等工作时，应在红光灯下进行照射和后继操作，并放置在黑暗条件下培养。,三、DNA损伤的修复,1、光复活作用,2、切除修复,暗修复，细胞的主要修 复系统，涉及UvrA、 UvrB、Uv

8、rC、 UvrD,3、重组修复,4、SOS修复,DNA分子在遇到较大范围的重大损伤时，诱导产生的一种应急机制。,越过损伤直接进行的修复。,第五节 细菌基因转移和重组,微生物可通过多种途径进行水平方向的基因转移，这种基因的转移与交换是生物进化的动力之一。,接合 (conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化(natural genetic transformation)：,游离DNA分子 + 感受态细胞,一、细菌的接合作用(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,1.实

9、验证据,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,2. 机制,(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导,F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛 （sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。,含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛,不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c

10、）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。,d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛。,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过 程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组 ，由此而得名为高频重组菌株。,2）Hfr F-杂交,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会 就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,F因子不易转入受体细胞中，故HfrF- 杂交后的受体细胞（或称接合子）大多 数仍然是F-。,3）FF-杂交,Hfr

11、菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子， 特称为F因子。,FF-与F+F-的不同：给体的 部分染色体基因随F一起转入受体细胞,a）与染色体发生重组；,b）继续存在于F因子上， 形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导 （F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。,二、细菌的转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式： 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA

12、 带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,1、普遍性转导（generalized transduction）,噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程,(1) 意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外 的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型 的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：,用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞 不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研

13、究却导致 一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的 P22噬菌体介导的,（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,(2) 转导模型,发生频率：10-6-10-8,通过同源重组形成转导子,转导噬菌体为什么“错” 将宿主的DNA包裹进去?,噬菌体P22的DNA包装酶酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点 并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳， 形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。,因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8,形成转导颗粒的噬菌体

14、可以是温和的也可以是烈性的，但必须 具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解 以前进行包装。,普遍性转导的基本要求：,普遍性转导的三种后果：,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体 的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导（abortive transduction）,转导DNA不能进行重组和复制，但其 携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，转导失败。,DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA， 而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,2、局限性转导（specialized transduction）,（参见P219）

15、,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上 宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,2、局限性转导（specialized transduction）,温和噬菌体裂解时的 不正常切割：包含gal或bio基因 （几率一般仅有10-6）,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、 包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。 但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过 DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,局限性转导与

16、普遍性转导的主要区别：,a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起 进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的 可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因 导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基 因具有随机性。,2、局限性转导（specialized transduction）,溶源转变（lysogenic conversion）：,一个与转导相似又不同的现象,温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因 整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。,溶源转变与转导的不同？,a）不携带任何供体菌的基因

17、；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,三、细菌的遗传转化（genetic transformation）,定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然 或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。,自然遗传转化（natural genetic transformation）,人工转化（artificial transformation）,感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞,（competent cell）,自然感受态与人工感受态的不同？,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性， 受细菌自身的基因控制；,人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有

18、摄取 DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,1、自然遗传转化（简称自然转化）,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,建立了感受态的受体细胞,外源游离DNA分子,枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,自然转化过程的特点：,a）对核酸酶敏感；,c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA） 给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；,d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；,提

19、高质粒的自然转化效率的二种方法： 1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高； 2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转 化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组获救,b）不需要活的DNA给体细胞；,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(transfection)：,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞 并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,自然遗传转化的进行涉及到细菌染色体上几十个 基因的功能及彼此间的相互协调，因此被认为是 名副其实 的细菌水平基因转移途径。,目前的

20、研究热点：,1）细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化， 即该过程的生物学意义到底何在？它对细菌自身有什么好处？ （人们已提出了一些假说，但均不圆满）,2）自然转化过程的很多细节仍不清楚，包括细菌如何协调感受态 的建立，外源DNA进入和重组的具体过程等等,3）细菌中具有自然转化能力的范围，到底有那些菌具有自然 转化能力？,4）转化DNA的来源和在自然环境中发生的自然转化,2、人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞

21、，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,原生质体融合：,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。,技术路线：,亲本菌株A,亲本菌株B,脱壁,方法？,原生质体A、B,遗传标记,遗传标记,助融剂,等渗培养基，再生出菌落,选择培养基， 筛选目标菌,第七节 微生物育种,一、自发突变与育种 （breeding by spontaneous mutation） 1.从生产中育种 仔细观察，做“伯乐” 2.定向培育优良菌株 卡介苗（BCG vaccine）：Bacillus Calmette-Guerin

22、,A.Calmette,C.Guerin,二、诱变育种 （breeding by induced mutation）,诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验和生产实践使用。,常用的诱变方法： 紫外线 化学诱变剂,诱变育种的几个原则,1.选择简便有效的诱变剂,诱变剂,物理诱变剂：,化学诱变剂：,紫外线、激光、离子束、rRay,烷化剂、碱基类似物等,2.挑选优良的出发菌株,依靠经验,3.处理单细胞或单孢子悬液,应尽量选用单核细胞，丝状菌应选用单孢子。,4.选用最适的

23、诱变剂量,剂量存活率曲线，剂量诱变率曲线,5.充分利用复合处理的协同效应,6.利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,利用蛋白酶水解圈、淀粉酶变色圈、纤维素水解圈等,7.设计高效筛选方案,8.创造新型筛选方法,结合具体的目标，大胆尝试，勇于创新。,1.营养缺陷型突变株的筛选,筛选策略,2.抗阻遏和抗反馈突变型,选育AECr突变株,表型特征：当细胞中已有大量最终代谢产物积累的情况下,仍能不断地合成这一产物。,选育结构类似物抗性突变株。,3.抗性突变株,三、代谢工程育种,利用基因工程技术对微生物代谢网络中特定代谢途径进行有精确目标的基因操作，改变微生物的代谢调节系统，使目的产物产量大幅提高的一种育种技术。,改变代谢途径,XDH,AraDH,葡萄糖,D-阿拉伯糖醇,D-木酮糖,木糖醇, 扩展代谢途径,某Bacillus subtilis 中的合成酶基因及其上下游基因序列,例1,例2,P43 476bp,构建方案,B. subtilis 168,pP43NMK 7680bp,P43,P43,PCR,MCS多克隆位点,ywsC 、 ywtA ywtB,Overlap PCR,构建新的代谢途径,