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1、第五章 病原菌的检验,主要的食物导致的疾病,肠道杆菌,正常菌群,致病菌,埃希菌属（EC）,变形杆菌属,克雷伯菌属,肠杆菌属,沙雷菌属,枸橼酸菌属,肠外感染,肠外感染,食物中毒,医院感染,致病性大肠埃希菌属（EC）,EPEC、ETEC,EIEC、EHEC,EAggEC,肠内感染,食物中毒,志贺菌属,A群痢疾志贺菌,B群福氏志贺菌,C群鲍氏志贺菌,D群宋内志贺菌,急性菌痢,慢性菌痢,中毒性菌痢,沙门菌属,肠道沙门菌,邦戈沙门菌,伤寒沙门菌,甲型副伤寒沙门菌,乙型副伤寒沙门菌,丙型副伤寒沙门菌,肠热症,鼠伤寒沙门菌,猪霍乱沙门菌,肠炎沙门菌,食物中毒,败血症,耶尔森菌属,小肠结肠炎耶尔森菌,鼠疫耶尔
2、森菌,食物中毒,鼠疫,大肠埃希菌是肠杆菌科细菌中，从各种温血动物的肠道中检出率最高的菌种。 最早是由埃希（ Escherich）1895年在粪便中发现而命名，又称大肠杆菌（coli），在鱼类、两栖类、昆虫的肠道中也存在。 从新生儿开始就终生存在，与人体是共栖关系，人体供给它生长条件，而这类菌的代谢产物能抑制肠道内其它分解蛋白质的细菌的生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，并能合成VB,VK,供人体吸收利用。,第一节 大肠埃希菌(Escherichia coli),是一种条件致病菌。当机体免疫力降低时，或侵入肠外组织，可引起肠道外感染，如肾炎、胆囊炎、胆结石、膀胱炎、肺炎、败血症等。 有些菌株致
3、病性强，能直接导致肠道感染。 药品、食品中有无大肠埃希菌及数量多少，可判断药品、食品是否被粪便污染及污染的程度。如果检出该菌，表明被粪便污染，且有可能污染伤寒、痢疾或其他肠道致病菌,1.形态与染色 是两端钝圆的革兰氏阴性短小杆菌，有时近球形 （1.1-1.5）m (2.0-6.0)m 无芽孢，以周身边毛运动或不运动，某些菌株具有荚膜。,一、大肠埃希菌的生物学特性,2.培养特性,最适温度37 ，可在15-46 生长. 最适pH7.4-7.6。 需氧或兼性厌氧。 在EMB平板上，典型菌落呈紫黑色，有金属光泽； 在药品中分离到的菌株也有菌落呈粉色，无金属光泽，中心紫色，扁平，低度突起，光滑湿润。 致
4、病菌的菌落无色，透明或半透明。但由于药物的影响，有可能改变，应挑取多种菌落进行鉴定。,3.生化特性,能迅速分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等多种糖类，产酸产气。产生的丙酮酸可分解为乳酸、乙酸、甲酸。甲酸又被分解为二氧化碳和氢气。 不分解尿素 IMViC 反应+-,4.抗原结构,菌体抗原（O抗原）：是细胞壁成分。耐热、121 不破坏，有171种血清型。 表面抗原（K抗原）：是存在于荚膜、被膜体表部分的抗原。不能被O血清所凝集，具有O不凝集性。 鞭毛抗原（H抗原）：由不耐热的蛋白质组成，60 被破坏。共有56个血清型。 抗原式为：O111K58H12,5.抵抗力 对热的抵抗力较强 在自然界中可存活
5、数周至数月 对磺胺类、四环类等抗生素敏感 对煌绿染料比沙门氏菌敏感 耐胆盐 对漂白粉、酚、醛等敏感,6.致病力 侵袭力:K抗原、菌毛 内毒素：类脂A 肠毒素：肠产毒型大肠杆菌类似于霍乱弧菌。产生两类肠毒素。均在质粒中编码。,致病性大肠埃希菌主要分为五类：,肠产毒型（enterotoxigenic E.coli ,ETEC） 肠致病型 (enteropathogenic E.coli ,EPEC) 肠侵袭型 (enteroivasive E.coli ,EIEC) 肠出血型 (enterohemorrhagic E.coli ,EHEC)：又称Vero毒素大肠埃希菌（Verotoxigenic
6、E.coli ,VTEC ），O157：H 肠粘附型(enteroadherent, E.coli ,EAEC)：肠聚集型,引起腹泻的大肠埃希菌种类及主要特征,大肠杆菌O157,1982年在美国的一次汉堡包食物中毒事件中首次被发现。 96年在日本流行。 寄生在牛、羊等动物的肠道内以及土壤和污水中，中毒者往往都伴有剧烈的腹痛、高烧和血痢，病情严重者会危及生命。 美国威斯康星大学绘制出其完整基因组图谱。发现了1387个特有的新基因。 具有一些被称为“DNA岛”的特殊片断，像岛屿一样分散在整个基因组中。其中一些“DNA岛”里包含有与致病过程有关的基因，能够控制产生毒素，或帮助O157更牢固地附着在肠
7、胃中。,大肠杆菌O26,英2年死83人, 可导致血液感染及尿道感染，年纪较大或患有其他严重疾病的感染人士很可能出现其他并发症。 导致血液感染的大肠杆菌个案，在过去10年来已上升1倍； 抗药性的个案从2001年的2%上升至2004年的6%。,二、大肠埃希菌检查法,供试品,供试液,胆盐乳糖增菌,MacC EMB,纯培养,乳糖发酵,IMViC,报告,革兰氏阴性无芽孢杆菌 乳糖产酸产气或产酸不产气 IMViC试验为+-或-+- 判为检出大肠埃希菌,IMViC,靛基质试验(indol test)： 取培养物接种于胨水培养基，培养24-48h，沿管壁加入柯凡克试剂数滴，液面呈玫瑰红色为阳性. 原理： 含有
8、色氨酸酶的细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，形成吲哚。吲哚无色，加入对二甲氨基苯甲醛后，形成红紫色醌式化合物，即玫瑰吲哚。,甲基红试验(methyl red test)：取培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养48h，沿管壁加入甲基红试剂5-6滴，液面呈鲜红色或橘红色为阳性。 原理：细菌发酵葡萄糖，在磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，发酵产酸，使甲基红试剂变色而呈阳性反应。有的细菌可使pH下降至于4.5或更低；有的则使发酵产物脱羧而产生中性乙酰甲基甲醇，使pH回升至5.4以上。,乙酰甲基甲醇生成试验,(Voges-Prokauer test)：取培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养48h，沿管壁加入a
9、萘酚乙醇试剂1mL，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4mL，摇匀，4h内出现红色为阳性。 原理：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，再脱羧生成乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中氧化生成二乙酰（丁二酮）。再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成红色化合物。一般情况下，与甲基红反应呈相反结果。,柠檬酸盐利用试验(citrate test)：取培养物接种于柠檬酸盐培养基，培养2-4天，斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性。 原理：柠檬酸盐利用培养基是合成培养基，不含蛋白胨和糖类，以柠檬酸钠为惟一碳源，磷酸二氢铵为唯一铵盐，细菌在柠檬酸盐利用培养基生长，柠檬酸钠被分解生成碳酸钠与水，使培养基pH升高，溴麝香草酚蓝指示剂
10、显蓝色。,硫化氢试验,将细菌穿刺接种于三糖铁琼脂或克氏双糖铁琼斜面、或硫酸亚铁琼脂中，24-48h，培养基底层出现黑色即为阳性反应。 原理：细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的有还原作用，生成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化亚铁。,血清学试验,假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用各类大肠埃希氏菌的多价O血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一单价O血清呈强凝集反应，即为假定试验阳性。 证实试验:制备O抗原悬液,稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。将O血清用生理盐水稀释至1：
11、40。在试管内等量混合，做试管凝集试验。混匀后在50水浴箱内16h后观察结果。出现凝集则可证实为O抗原。,氧化酶试验,待检菌新鲜培养物,挑菌落于滤纸,3618-24h,氧化型色素,阳性,细胞色素氧化酶,四甲基对苯二胺盐酸盐,a-萘酚乙醇溶液1-2滴,还原型色素,吲哚酚蓝,避免同铁镍接触 避免用含葡萄糖培养基 菌落新鲜 试剂新鲜 有氧条件,三、MUG-Indole检查法,1.原理 97%的大肠埃希菌和部分志贺菌、沙门氏菌中含有-葡萄糖醛酸苷酶（ -glucuronidase,GUD ）。利用目标菌的限定酶作用的底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖酸苷（4-Methylumbelliferyl- -D-
12、Glucuronide, MUG）被-葡萄糖醛酸苷酶分解，在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光作为指示系统来鉴定目标菌。 但漏检率为6%，因此采用与吲哚反应相结合，辅以IMViC试验，在理论上检出率可达99%。24-48h可报告结果。,2.检验程序,供试品,供试液,BL增菌液,MacC EMB,疑似菌落纯培养,乳糖发酵,IMViC,报告,MUG蛋白胨,MUG+，I+,MUG-，I-,MUG+，I-,MUG-，I+,革兰染色,报告,3.注意事项,配制MUG培养基时，务必校正pH值，pH不得过7.4，否则MUG管自身发荧光。 培养时间一般4h，24h，可延长48h。 结果观察时要将阳性对照管、阴性对
13、照管和供试品的MUG管同时在366nm紫外灯下观察，如阳性管荧光强烈时，可移去，以免影响另两管的观测。,四、肠毒素检验,1.产毒培养：将试验菌株和对照菌株分别接于0.6mL产毒素培养基内，37振荡培养过夜。加入适量多粘菌素，37培养1h，4000r/min离心15min，取上清，加入适量硫柳汞，4保存待用。 2.ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）检测LT和ST,间接法,双抗体夹心法检测LT,结果判定：以酶标仪在492nm下测定吸光度OD值，待测样本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性。或目测为橘黄色。,抗原竞争法检测ST,抗原竞争法测ST,结果判定：
14、以酶标仪在492nm下测定吸光度OD值。 阴性对照OD值-待测样本OD值 阴性对照OD值 目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。,100%50%,3 反向乳胶凝集法 （resersed passive latex agglutination, RPLA）,包被了抗体的乳胶粒子,毒素（抗原）,检样,大肠菌群MPN,25g+营养肉汤,严重污染,乳糖发酵阳性管,菌落3-5个，氧化酶阴性,EMB Macc,肠道增菌肉汤,TSI、吲哚、尿素酶、KCN、LYS、动力,TSI底层+、H2S-、尿素酶-、KCN-,血清学试验,ETEC+,EPEC+、EHEC+、O157H,EIEC+,非左,非左,非大肠埃希菌,肠毒素+,吲哚+、 LYS -、动力-、O124-/+,产肠毒素大肠埃希菌,致病性或出血性大肠埃希菌,侵袭性大肠埃希菌,非致泻大肠埃希菌,五 检测程序图,快速检测,绿蓝色菌落为O157,红色菌落为大肠杆菌。 蓝色菌落为其它大肠菌群,