《无菌操作技术(二).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《无菌操作技术(二).ppt（44页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、无菌操作技术,组员：赵华 赵诣 陈珩 杜宇菲 高宝才 高瑞钰 讲解：高宝才 PPT制作：杜宇菲 高瑞钰 资料查找人：赵华 赵诣 陈珩,无菌操作技术,无菌：在科学研究和生产实践中使用的微生物必须是单一的纯种或菌株，不能存在杂菌（非目的菌）。,无菌操作,防止微生物进入机体或物体的方法,在微生物操作过程中，除了使用的容器、用具（试管、三角烧瓶、平皿和吸管等）和培养基必须进行严格的灭菌处理外，还要通过一定的技术来保证目的微生物在转移过程中不被环境中的微生物污染，这些技术包括用接种环（针）、吸管、涂棒等工具进行接种、稀释、涂片、计数和划线分离等。,实验目的,1.学习掌握培养基的配制原理，同时通过对几种培
2、养基的配制掌握配 制培养基的一般方法和步骤。 2.了解高压蒸汽灭菌的原理和应用范围，学习高压蒸汽灭菌的操作技术。 3.证实实验室环境与人体表面存在微生物，体会无菌操作的重要性。,实验目的,4.熟练掌握从固体培养物和液体培养物中转接微生物的无菌操作技术，熟知各种菌种保藏方法，以及各个方法的特点和区别。 5.学习并掌握微生物的制片和简单染色的基本技术，初步了解细菌的形态特征。巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。,实验原理,1. 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养
3、基也有不同的种类和配制方法。,实验原理,2高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内地冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时，由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100摄氏度的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的,实验原理,3要知道我们周围存在看得见的微生物可以通过两种方法：一种是通过放大微生物个体，是我们能够看到它们；另一种方法是通过“放大”成子细胞群体（菌落），使我们看到它们的存在，即通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌
4、聚集在一起的肉眼可见的菌落。,实验原理,4. 高温对微生物具有致死效应，因此在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环（针、铲），以达到灭菌的目的，但一定要保证其冷却后方可进行转接，以免烫死微生物。如果是转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃吸管或吸嘴；如果只取少量而且勿需定量也可用接种环，视实验目的而定。,实验原理,5.通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学形状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。保藏菌种的方法包括传代培养保藏、冷冻保藏和干燥保藏。,实验原理,6.
5、对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹使细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。,实验原理,7.利用单一燃料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的燃料是一类苯环上带有发色基因和助色基因的有机化合物。发色基因赋予燃料颜色特征，而助色基因使燃料能够形成盐。不含助色基因而仅具有发色基因的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作燃料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。常用的微生物细胞燃料都是盐，分碱性染料和酸性燃料，前者包括美蓝、结晶紫、碱
6、性复红、沙黄及孔雀绿等，后者包括酸性复红、伊红及刚果红等。通常采用碱性燃料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色；当细胞处于酸性条件下所带正电荷增加时，可采用酸性燃料染色。,实验材料,1.牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，KNO3,K2HPO4.3H2O,MgSO4.7H2O,FeSO4.7H2O,KH2PO4,葡萄糖，孟加拉红（1%的水溶液），链霉素（1%水溶液），1 mol/L NaOH,1mol/L HCL，3%5%石炭酸或2%3来苏尔溶液，2%的葡萄糖溶液，无菌水，金黄色葡萄球菌24h牛肉膏蛋
7、白胨琼脂斜面培养物，草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液，吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉蓝染液等。,实验材料,2.试管，三角烧瓶，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布，培养皿，吸管，电热干燥箱，紫外线灯，注射器，微孔滤膜过滤器，0.22um滤膜，镊子，玻璃刮棒，灭菌棉签，试管架，煤气灯或酒精灯，废物缸，接种环，无菌玻璃吸管，吸气器，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶，擦镜纸，平皿，u型玻棒，滴管，解剖针，解剖刀，生理盐水，50乙醇，20%甘油 ，高氏一号培养基平板，马铃薯琼脂薄层平板等。,实验步骤,一、牛肉膏蛋白胨培
8、养基的制备 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 水 1000mL pH 7.47.6,实验步骤,1.称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或玻璃皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可以放在纸上称量，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 2.融化：在上述烧杯中先加入少许所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。,实验步骤,3.调pH：在未调pH之前，先用精密pH试纸测量培养基原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/
9、L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直到pH达到7.47.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。 4.过滤：趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验勿需过滤）。,实验步骤,5.分装：按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内和三角烧杯内。 液体分装：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角烧瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角烧瓶容积的1/2为宜，如果是用于振荡培养，则应根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，须要补加一定量的无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。 固体分装：试管分装，其装量不超过管高的
10、1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶的容积的1/2为宜。 半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。,实验步骤,6.加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染。 7.包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆绑好，再在面塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳包好。用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。,实验步骤,8.灭菌：将上述培养基以0.1MPa，121，2
11、0min高压蒸汽灭菌。 9.搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50左右（以防斜面上冷凝水太多）将试管口端搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一般为宜。 10.无菌检查：将灭菌培养基放在37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。,实验步骤,二、无菌试验 1.标记 分别在两套平板的底部划分出四个小区，并在其边缘上写上自己的名字和日期，在四个小区内分别标明待接种的样品名称，为了不影响观察，可用符号或数字代表。在另外两套平板的底部，用记号笔写上姓名、日期以及“空气1”和“空气2”。 2.人体表面微生物的观察 手指表面：在火焰旁，半开皿盖，用洗前的手指在平板的A区域轻
12、轻按一下，迅速盖上皿盖。然后用肥皂洗手两次，自然干燥后，在B区轻轻按一下，迅速盖上皿盖。,实验步骤,3.实验室环境的检查 将标有“空气1”的平板在实验室打开皿盖，使琼脂培养基表面完全暴露在空气中；将另一个标有“空气2”的平板放在已灭菌的无菌操作箱（室）内，打开皿盖，1h后盖上两个皿盖。 取出灭菌湿棉签，在实验台面擦拭约2cm2的范围，然后将棉签从平板的开启出伸进平板表面，在E区滚动一下，立即闭合皿盖，放回棉签。用同样的方法将擦拭了门旋钮的棉签在F区进行滚动接种，将沾有灰尘的棉签在G区接种。将灭菌棉签在H区接种。,实验步骤,4.培养 将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，置37培养12d。,实验步骤
13、,三、接种 （一）、用接种环转接菌种 1.用记号笔分别标记3支肉汤营养琼脂斜面为A（接菌）、B（接无菌水）、C（非无菌操作）和3支液体培养基为D（接菌）、E（接无菌水）和F（不接种）。 2.左手持大肠杆菌斜面培养物，右手持接种环，将接种环进行火焰灼烧灭菌(烧至发红），然后在火焰旁打开斜面培养物的试管帽（管帽不能放在桌上），并将管口在火焰上烧一下。,实验步骤,3.在火焰旁，将接种环轻轻插入斜面培养物试管的上半部（此时不要接触斜面培养物），至少冷却5s后，挑取少许培养物（菌苔）后，再烧一下管口，盖上管帽并将其放回试管架中。,实验步骤,4.用左手迅速从试管架上取出A管，在火焰旁取下管帽，管口在火焰上
14、烧一下，将沾有少量菌苔的接种环迅速放进A管斜面的底部（接种环不要碰到试管口边）并从下至上划一直线，然后再从其底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，同样烧一下管口，盖上管帽，将接种环在火焰上灼烧后放回原处。如果是向盛有液体培养基的试管和三角烧瓶中接种，则应将挑有菌苔的接种环首先在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。,实验步骤,5.按上述方法从盛有无菌水的试管中取一环无菌水于B管中，同样划线接种。 6.以非无菌操作为对照：在无酒精灯或煤气灯的条件下，用未经灭菌的接种环从另一盛有无菌水的试管中取一环水划线接种到C管中。 上述无菌操作技术也可将待接和被接的2支试管同时拿在
15、左手上进行。,实验步骤,（二）、用吸管转接菌液 1.轻轻摇动盛菌液的试管（不要溅到管口或管帽上），暂放回试管架上。 2.从已灭菌的吸管筒中取出一支吸管，将其插入吸气器下端，然后按无菌操作要求，将吸管插入已摇匀的菌液中，吸取0.5ml菌液并迅速转移至D管中。 3.取下吸气器，将用过的吸管放入废物筒中。筒底必须垫有泡沫塑料等软垫，以防吸管嘴破损。 4.换另一支无菌吸管，按上述同样方法从盛无菌水的试管中吸取吸取0.5ml菌液转移至E管中。 在使用吸管操作过程中，手指不要接触其下端。,实验步骤,五、细菌制片及简单染色 1.涂片 取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域并标记；各滴一小滴生理盐水于两个区域
16、中央；用接种环无菌操作分别由枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养基涂片，可用接种环蘸取12环菌液直接涂于载玻片上。,实验步骤,2.干燥 自然干燥或用电吹风干燥。 3.固定 涂菌面朝上，通过火焰23次。 4.染色 将载玻片平放于载玻片支架上，滴加染液覆盖涂菌部位即可，吕氏碱性美篮1.5min，草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染液1min。 5.水洗 倾去染液，自来水冲洗，水流不宜过急、过大，勿直接冲涂片处，至洗出无色水为止。,实验步骤,6.干燥 用吸水纸吸去多余水分，自然干燥或
17、用电吹风干燥。 7.镜检 将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录。,实验结果,注意事项,1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。 3.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 4无菌操作需要在火焰旁进行，因此，在操作时要小心，不要将手烫伤。 5.禁止用嘴吸取菌液 6.用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。 7.滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。 8.盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。,思考,因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 如果
18、压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。,1. 高压蒸汽灭菌开始之前为什么要将锅内的冷空气排尽？,思考,首先要记住：没有一种条件或培养基能使所有的微生物生长。本实验中所用的培养基是一种丰富培养基，可以支持大量不同的微生物生长，因此可以满足本实验的要求。,2.为什么用肉膏蛋白胨琼脂培养基？,思考,答：防止菌种污染环境，违背无菌操作技术原则。,3. 为什么接种完毕后，接种环还必须灼烧后再放回原处，吸管也必须放进废物筒中？,思考,答：1.产生的高温可以消灭细胞，避免细胞交叉污染 2.火焰的温度能够使气流
19、形成负压，在酒精灯周围10cm处形成一个无菌区。,4. 为什么酒精灯外焰可以形成无菌区域,小结,1.获得试验成功的关键牢固树立无菌概念，细心、认真体会无菌操作的要领。 2.了解掌握不同菌落形态,细菌,细菌是原核微生物，故形成的菌落也小；细菌个体之间充满着水分，所以整个菌落显得湿润，易被接种环挑起；球菌形成隆起的菌落；有鞭毛细菌常形成边缘不规则的菌落；具有荚膜的菌落表面较透明，边缘光滑整齐；有芽孢 的菌落表面干燥皱褶；有些能产生色素的细菌菌落还显出鲜艳的颜色。较难挑起。,霉菌,常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有时还能呈红、褐、绿、黑、黄等不同颜色,酵母菌,大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。,大肠杆菌,在普通琼脂培养基上面都是一样的,圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起。典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。镜检为革兰氏阴性（红色）无芽孢杆菌。,金黄色葡萄球菌,在BP培养基上，圆形，光滑，凸起湿润，颜色呈黑灰色，边缘整齐、周边浑浊，外层有一透明带。在血平板上，圆形，金黄色，凸起，表面光滑，有溶血圈。镜检为革兰氏阳性，呈葡萄状排列。,谢谢,THANKS！,