酶工程8模拟酶.ppt

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1、第八章 酶的人工模拟或模拟酶,第一节 模拟酶的理论基础和策略,模拟酶的概念 二十世纪的大部分时期，科学家一直在利用化学模拟作为阐明自然界中生物体行为的基础。,早在二十世纪中叶，人们就已认识到研究和模拟生物体系是开辟新技术的途径之一，并自觉地把生物界作为各种技术思想、设计原理和发明创造的源泉。 通过对生物体系的结构与功能的研究，为设计和建造新的技术提供新的思想、新原理、新方法和新途径。,设计一种象酶那样的高效催化剂是科学家们一直追求的目标。而对酶功能的模拟是当今自然科学领域中的前沿课题之一。,在过去的20年里，化学家对利用简单的分子模型构建酶的特征进行了深入的研究。 经过长期的努力，新的催化剂

2、模拟酶就逐渐被研制和开发出来。,模拟酶又称人工酶或酶模型。 生物有机化学的一个分支。,由于天然酶的种类繁多，模拟的途径、方法、原理和目的不同，对模拟酶至今没有一个公认的定义。,一般说来，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。,模拟酶的研究就是吸收酶中那些起主导作用的因素利用有机化学、生物化学等方法，设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。,因此，模拟酶是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。,迄今为止，已经有了多种类型的模拟酶： 小分子仿酶体系有环糊精

3、、冠醚、环 番、环芳烃和卟啉等大环化合物等。 大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分 子印迹酶模型和胶束酶模型等。 利用化学修饰、基因突变等手段改造 天然酶产生了具有新的催化活性的半 合成人工酶。,其中，抗体酶就是一个典型的例子，抗体酶的出现和快速发展为酶的人工模拟又开辟了一条新的道路。,二、模拟酶的理论基础,1模拟酶的酶学基础 酶是如何发生效力的？对酶的催化机制，人们提出了很多理论，试图从不同角度阐述酶发挥高效率的原因。,在众多的假说中，Pauling在1946年提出的的过渡态理论得到了广泛的认同。,基于Pauling稳定过渡态理论，目前对酶的催化机制解释是酶先与底物结合，进而选择性稳定某一特定反

4、应的过渡态(TS)，降低反应的活化能，从而加快反应速度。,设计模拟酶： 基于酶的作用机制， 基于对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究。 要想得到一个真正有效的模拟酶，这两方面就必须统一结合。,在设计模拟酶时除具备催化基团之外，还要考虑到与底物定向结合的能力。模拟酶要和酶一样，能够在底物结合中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应的活化能。,酶模型的催化基团和底物之间必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化效力是相当重要的。,2. 超分子化学 Pederson和Cram报道了一系列光学活性冠醚的合成方法。这些冠醚可以作为主体而与伯铵盐客体形成复合物。,Cram把主

5、体与客体通过配位键或其它次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主-客体”化学(host-guest chemistry)。,主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补，这种主客体互补与酶和它所识别的底物结合情况近似。,主-客体化学和超分子化学已成为酶人工模拟的重要理论基础，是人工模拟酶研究的重要理论武器。 根据酶催化反应机理，若合成出能识别底物又具有酶活性部位催化基团的主体分子，就能有效地模拟酶的催化过程。,通常，在设计模拟酶之前，应当对酶的结构和酶学性质有深入的了解： (1)酶活性中心-底物复合物的结 构； (2)酶的专一性及其同底物结合的

6、 方式与能力； (3)反应的动力学及各中间物的知 识。,设计人工酶模型应考虑如下因素： 非共价相互作用是生物酶柔韧性、可变性和专一性的基础，故酶模型应为底物提供良好的微环境，便于与底物，特别是反应的过渡态以离子键、氢键等结合； 精心挑选的催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近，以促使反应定向发生； 模型应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。,在设计模拟酶方面，尽管有上述理论做指导，但是，目前尚缺乏系统的定量的理论体系。,令人欣喜的是，大量的实践证明，酶的高效性和高选择性并非天然酶所独有，人们利用各种策略发展了多种人工酶模型。 目前，在众多的模拟酶中，已有部分非常成功

7、的例子，它们的催化效率和高选择性已能与生物酶相媲美。,第二节 模拟酶的分类,根据Kirby分类法，模拟酶可分为： (1)单纯酶模型(enzyme-based mimics)，即以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性； (2)机理酶模型(mechanism-based mimics)，即通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成； (3)单纯合成的酶样化合物(synzyme)，即一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。,按照模拟酶的属性，模拟酶可分为： (1)主客体酶模型，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等； (2)胶束酶模型； (3)

8、肽酶； (4)抗体酶； (5)分子印迹酶模型； (6)半合成酶等。,近年来又出现了杂化酶和进化酶。对酶的模拟已不是仅限于化学手段，基因工程、蛋白质工程等分子生物学手段正在发挥越来越大的作用。化学和分子生物学方法的结合使酶模拟更加成熟起来。,一、主客体酶模型 1环糊精酶模型 环糊精(Cyclodextrin 简称 CD)是由多个D-葡萄糖以(1,4)糖苷键结合而成的一类环状低聚糖。,每个葡萄糖残基均呈现无扭曲变形的椅式构象，整个分子组成类似轮胎的环柱形分子，分子内有空穴，其大小、形状是由组成环的葡萄糖残基数目而定的,环糊精,根据葡萄糖单元的数量不同可分为 (6个)，(7个)及(8个)环糊精三种,

9、CD略呈锥形的圆筒， 其伯羟基（C6）和仲羟基（C2、C3）分别位于圆筒 较小和较大开口端。 这样，CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体形成氢键，其内侧是C-3，C-5上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，故具有疏水性，因而能包结多种客体分子，很类似酶对底物的识别。,作为人工酶模型的主体分子虽有若干种，但迄今被广泛采用且较为优越的当属环糊精。,CD分子和底物的结合常数不及某些酶对底物的结合常数大，因此以CD为主体的仿酶研究工作过去主要集中在对CD的修饰上，即在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，以改善CD的疏水结合和催化功能。 这样得到的修饰CD通常只有单包结部位和双重识别

10、作用。,由于酶是通过对底物的多部位包结并具有多重识别位点来实现酶促反应的高效性和高选择性的。为了增加环糊精的仿酶效果，近年来相继出现了桥联环糊精和聚合环糊精。以它们为仿酶模型可以得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用。,利用环糊精为酶模型已对多种酶的催化作用进行了模拟。 在水解酶、核糖核酸酶、转氨酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和羟醛缩合酶等方面都取得了很大的进展。,水解酶的模拟 -胰凝乳蛋白酶是一种蛋白水解酶。它具有疏水性的环状结合部位，能有效包结芳环，催化部位中含有57号组氨酸咪唑基，102号天冬氨酸羧基及195号丝氨酸羟基，三者共同组成了所谓的“电荷中继系统”，在催化底物水解时起关键

11、作用。,-胰凝乳 蛋白酶,-胰凝乳蛋白酶的模拟:在-环状糊精的侧链上接上一些基团，合成出了如下图的模拟酶。利用-环状糊精作为酶的结合部位，使羧基、咪唑基以及环糊精自身的羟基共同构成了催化中心，由此实现了-胰凝乳蛋白酶的全模拟。,-胰凝乳蛋白酶的模拟酶,Bender等人将实现了电荷中继系统的酰基酶催化部位引入CD的第二面，成功地制备出人工酶-Benzyme 。,-Benzyme,-Benzyme催化对叔丁基苯基醋酸酯(p-NPAc)的水解比天然酶快一倍以上，kcat/K m也与天然酶相当。 -Benzyme曾以实现了天然酶的高效催化作用机理而闻名于世。,组氨酸咪唑基在酶催化中起着重要作用，将咪唑

12、与环糊精相连结会获得更理想的模拟酶。,Rama等人将咪唑在N上直接与-CD的C-3相连，所得的模型2催化p-NPAc的水解比天然酶快一个数量级。,著名科学家Breslow在环糊精仿酶领域做了大量而出色的工作。 认为模拟酶增加催化效率的关键是要增加环糊精对底物过渡态的结合能力。,最简单的方法是修饰底物来增加底物同 CD的结合，从而可能增加对过渡态的结合。 设计了一系列以二茂铁(二环戊二烯基合铁)、金刚烷(三环癸烷)为结合位点的硝基苯酯，以CD本身为催化剂可加速酯水解达105106倍。,核糖核酸酶的模拟 核糖核酸酶有两个组氨酸咪唑基及一个质子化赖氨酸氨基处于活性中心，在它的催化下RNA的磷酸酯水解

13、分两步进行，两个咪唑基交替起着广义酸和广义碱的作用，使基团质子化或增加亲核基团的亲核性。,Breslow等人以-环状糊精为基础，引入其它的化学基团可以合成出如图的两种修饰环状糊精模拟酶A和B，这两种修饰环状糊精能够催化磷酸二酯的水解，被认为是很好的核糖核酸酶模型,当环状磷酸二酯在碱性条件下水解时，可同时产生产物C和D，而在模拟酶A的催化下水解反应只生成C，在模拟酶B的催化下水解反应只生成D。,修饰环状糊精模拟核糖核酸酶催化的水解反应, 转氨酶的模拟 磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是许多涉及氨基酸的酶促转化的辅酶。其中最重要的是转氨酶催化的酮酸与氨基酸之间的相互转化。吡哆醛(胺)本身亦能实现转氨作用，但

14、由于辅酶本身无底物结合部位，反应速度远不如酶存在时快。显然，有效的转氨酶模型除了具有辅酶体系外，还应有特定的结合部位，这种结合部位能够选择性地与底物形成复合物。,1980年报道了第一个人工转氨酶模型 。在它的存在下，苯并咪唑基酮酸转氨基酸速度比吡哆胺单独存在时快200倍，而且表现出良好的底物选择性。,转氨酶模型,由于-CD本身具有手性，可以预料产物氨基酸亦应该具有光学活性，事实上产物中D，L异构体的含量确实不同，说明该人工酶有一定的立体选择性。,Tabushi等人将催化基团氨基引入CD得到模拟酶。乙二胺的引入不仅使反应加速2000倍以上，还为氨基酸的形成造就了一个极强的手性环境。靠近乙二胺一面

15、的质子转移受到抑制，从而表现出很好的立体选择性。,转氨酶模型,Han等人合成了一系列含核糖的环糊精酶模型，它兼具核酸酶、连接酶、磷酸脂酶和磷酸化酶的活性 研究表明，核糖中的相临二羟基对催化起着关键作用。它水解环状磷酸脂的速率提高33倍。, 桥联环糊精仿酶模型 桥联CD是近年来发展起来的一类新型仿酶模型，它的两个CD及桥基上的功能基构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能更好的模拟酶对底物的识别与催化功能。,Breslow研究小组发展了一种新方法，试图利用组合化学技术筛选与环糊精客体具有高选择性结合的小肽分子，以便获得高活性的催化水解肽酶模型。他们制备了含镍的水扬酚环糊精复合物 。 以

16、它们为受体在三肽库中进行筛选。此库含有氨基酸编码AA3-AA2-AA1-NH（CH2）2-TentaGel, 库容为293（24389）。筛选结果表明，含有L-Phe-D-Pro X和D-Phe-L-Pro X结构的三肽对环糊精具有非常显著的选择性结合能力。这为获得高活性的肽催化水解酶模型开辟了一条新路。,胡罗卜素是人体所需的重要营养物质。其正中的双键被氧化后得到两分子的视黄醛，它是维生素A 的前体。胡罗卜素氧化酶(CDOs)可选择性地氧化C15=C15 键，从而将胡罗卜素转化为视黄醛。,为了模拟这一立体选择性的系统，French 等人合成了含卟啉的桥联CD，可以选择性地氧化C15=C15 键

17、。,他们的设计思路是： （1）合成的桥联CD对底物胡罗卜素的结合远 大于产物视黄醛，这样避免了产物抑 制； （2）引入能催化双键的金属卟啉作为活性中 心。,实验证明，尽管2、9位双键也被氧化，但是选择性催化C15=C15 键是主要的。同天然酶相比，模拟物催化底物中心双键的可能性相当，均为20-25%。,细胞色素是机体内重要的抗氧化酶。人们对它进行了多种模拟。以环糊精为主体分子合成了很多模型系统。,最主要的模型系统是最近Breslow研究小组合成的四桥联环糊精模拟P-450酶模型。,它的设计别巨匠心，它将P-450活性中心的金属卟啉分子与四个环糊精分子相连构成了既具有底物结合部位又有催化基团的小

18、分子酶模型。,为了催化甾体C-9 的特异性羟化，他们设计了与环糊精空腔特异性结合的底物。此底物分子是经甾体与叔丁基苯衍生物酯化，引入与环糊精特异结合的叔丁基苯。研究发现在亚碘酰基苯（PhIO） 氧化下，四桥联环糊精酶模型将底物2完全转化为C-6羟基5，表现出相当高的立体选择性。,谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC.1.11.1.9)为含硒酶，是生物体内重要的抗氧化物酶，能有效消除体内的自由基，同超氧化物歧化酶和过氧化氢酶共同作用，防止脂质过氧化。因而在治疗和预防克山病、心血管病、肿瘤等疾病具有明显效果。,但是，此酶的来源有限，稳定性差，以及分子量大等缺点，限制了它的实际应用，因此，人们把注意力集

19、中在对此酶的人工模拟上。,罗贵民等利用环糊精为底物结合部位，硒为催化基团，制备出系列双硒（碲）桥联环糊精)。硒（碲）化环糊精均表现很高的GPX活性，为世界上最好的GPX模拟物PZ51的4.3、7.5倍和46倍。,2、合成的主-客体酶模型 主客体化学和超分子化学的迅速发展极大地促进了人们对酶催化的认识，同时也为构建新的模拟酶创造了条件。除天然存在的宿主酶模型(如环糊精)外，人们合成了冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体用来构筑酶模型。 目前，科学家们已经获得了很多较成功的人工模拟酶。,合理的人工酶的设计首先是优化对底物的结合，其次是催化基团的定位。早期以冠醚和环番为宿主的模拟酶，尽管没有获得高

20、效催化，但却明显加速了反应速度。,Lehn等人制备了一个含有半胱氨酸残基的大环手性模拟酶。它具有与伯铵盐的络合能力，分子内的巯基将结合的二肽酯巯解。,例如它对甘氨酰苯甲氨酸对硝基苯酯盐L-异构体有较大的选择催化能力。伯铵盐在冠醚孔穴中的络合以及半胱氨酸巯基的参与可以生成S-酰化中间体，致使酯的水解速率提高103-104倍。 这种人工模拟酶兼具分子络合作用、手性识别作用和催化作用，与天然酶十分类似。,含氮大环聚胺质子化可以作为阴离子受体模拟酶的模型。,Lehn等人合成了一种优异的穴状配体24-冠-N6O2 。 它可利用电性作用力和氢键结合多聚磷酸阴离子。研究表明此酶模型在pH2.58.5之间可明

21、显水解ATP生成ADP或AMP，在催化过程中形成磷酰胺中间体，当pH=7时可加速ATP水解500倍。,最出色的合成配体可能是Cram等人制备的球状配体，它由环状尿素连结而成孔穴状结构。球状配体是Cram等人合成的-胰凝乳蛋白酶模拟物。它催化的目标为酰基转移反应。尽管它还不能模拟脱酰化过程，这种模拟酶的催化效率已与天然酶相当。,模拟酶的成功因素之一是结合作用。如果能将两种底物结合在同一结合部位就能很好地发挥作用。,Sanders等人制备了系列低聚卟啉，它能将适当的底物结合在同一空腔内而催化二者反应。结合控制着反应的立体化学，在Diels-Alder反应中，反式产物是顺式产物的103倍。,Rebe

22、k等人以氢键为驱动力，设计了酯的酰胺化酶模型。 它以嘌呤（adenine）衍生物为底物催化对硝基苯酯的酰胺化。,在室温下氯仿溶液中催化双底物，提高催化效率160倍。,冠醚化合物的模拟酶 冠醚具有和金属离子、铵离子以及有机伯铵离子形成稳定的络合物的独特性质，通过巧妙的设计，可将一些具有催化活性的基团连接到冠醚分子上，就能很好地模拟酶的催化作用。 由于手性冠醚分子在络合氨基酸酯时具有很高的选择性，也为模拟酶的活性部位设计提供了良好的基础。,1） 水解酶的模拟 以冠醚化合物分子的冠醚环作为结合部位，含醚侧臂或亚甲基为立体识别部位，侧臂末端为催化部位，可以合成出一系列冠醚水解酶模拟物.,冠醚水解酶模拟

23、物,A、B、C等三种模拟酶,冠醚模拟酶可有效模拟水解酶的催化能力 表 氨基-对-硝基苯酯释放对硝基苯酚的速率常数,在冠醚模拟酶A、B、C存在时，各种氨基酸的盐与冠醚环结合使在-SH附近底物有较高的浓度，可使反应速度加快。,2） 肽合成酶的模拟,模拟肽合成酶的含巯基冠醚化合物,模拟肽合成酶的冠醚化合物,二、 胶束模拟酶 在模拟生物体系的研究中，胶束模拟酶是近年来比较活跃的领域之一。它不仅涉及简单的胶束体系，而且对功能化胶束、混合胶束、聚合物胶束等体系也进行了深入的探索。,长链的疏水尾巴+ “头部”基团,单体,单层,胶束,临 界 胶 束 浓 度,胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物束缚，类似

24、于酶的结合部位。如果将催化基团如咪唑、硫醇、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接或吸附在胶束上，就有可能提供“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活性或部分酶活性的胶束模拟酶。,摸拟水解酶的胶束酶模型 组氨酸的咪唑基常常是水解酶的活性中心必需的催化基团。如将表面活性剂分子上连接上组氨酸残基或咪唑基团上，就有可能形成模拟水解酶的胶束。,例如，N-十四酰基组氨酸所形成的胶束催化对硝基苯酚乙酸酯的水解，其催化效率比不能形成胶束的N-乙酰基组氨酸高3300倍。,如果将上述含咪唑基的胶束中加入带羟基的表面活性剂N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)十八烷基氨溴化物，让它们共同催化对硝基苯酚乙酸酯(PNPA)的水解，

25、则发现这个酰基咪唑中间体形成后又分解，酰基从咪唑基上又转移到羟基上，与-胰凝乳蛋白酶水解一些底物很相似。,人们将表面活性剂利用化学反应偶联在一起，制备出单分子胶束模拟酶，这种模拟酶比一般胶束模拟酶优越，它既具备酶的疏水特性，同时又可以使催化基团引入疏水空腔，其催化效率提高了105倍。,2、辅酶的胶束酶模型 将疏水性维生素B6长链衍生物与阳离子胶束混合形成的泡囊体系中，在Cu 2+存在下可将酮酸转化为氨基酸，有效地模拟了以维生素B6为辅酶的转氨基作用，氨基酸的收率达52%。,3、金属胶束酶模型 金属胶束是指带疏水链的金属配合物单独或与其他表面活性剂共同形成的胶束体系，其作用是模拟金属酶的活性中心

26、结构和疏水性的微环境。该体系的研究目前已取得引人注目的成绩，特别是在模拟羧肽酶A、碱性磷酸酯酶、氧化酶、转氨酶等方面取得了很大成功。,Tonellato等人以-吡啶甲酸对硝基苯酚酯(PNPP)为底物，研究了不同表面活性剂配体在Cu2+或Zn2+存在时催化PNPP水解的性能。发现Cu2+、Zn2+的存在可使PNPP的水解速度显著增大，当Cu2+与相应的表面活性剂形成1：1配合物时，水解反应速度达到最大。,三、 肽酶 (pepzyme) 肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽，这是多肽合成的一大热点。,Johnsson等人为克服苯丙氨酸工业合成的关键步骤草酰乙酸脱羧反应中所用酶需

27、金属辅酶的不便，想探寻与此不同反应机理的不需金属辅酶的脱羧酶。,可借鉴的认识只有：胺可以催化草酰乙酸脱羧，其历程是先形成烯胺，进而脱去CO2。 然而尚未发现采用烯胺历程的天然脱羧酶，全新合理设计就成了唯一可行的方法。,基于胺催化脱羧的六大特征和-螺旋在催化活性中的重要性的认识，以烯胺机理设计出两个多肽。结果发现，其催化效率比丁胺高34个数量级，但比天然酶活性低得多。,Atassi和Manshouri利用化学和晶体图象数据所提供的主要活性部位残基的序列位置和分隔距离，采用“表面刺激”合成法将构成酶活性部位位置相邻的残基以适当的空间位置和取向通过肽键相连，而分隔距离则用无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸

28、调节，这样就能模拟酶活性部位残基的空间位置和构象。,设计合成的两个29肽ChPepz和TrPepz分别模拟了-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解蛋白的活性分别与其模拟的酶相同；在水解2个或2个以上串联的赖氨酸和精氨酸残基的化学键时，TrPepz比胰蛋白酶的活性更强。 对于苯甲酰酪氨酸乙酯的水解，ChPepz比-胰凝乳蛋白酶的活性稍小，而TrPepz则无活性。对于对甲苯磺酰精氨酸甲酯的水解，TrPepz比胰蛋白酶的活性稍小，而ChPepz则无催化活性。,四、 半合成酶 它是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。 半

29、合成酶的出现，是近年来模拟酶领域中的又一突出进展。,Bender等人首次成功地将枯草杆菌蛋白酶活性部位的丝氨酸（Ser）残基，经苯甲基磺酰氟特异性活化后，再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化为半胱氨酸。 虽然产生的巯基化枯草杆菌蛋白酶对肽或酯没有水解活力，但能水解高度活化的底物，如硝基苯酯等。,Hilvert等人利用类似的方法，将枯草杆菌蛋白酶结合部位的特异性Ser突变为硒代半胱氨酸。此硒化枯草杆菌蛋白酶既表现出转氨酶的活性又表现出含硒谷胱甘肽过氧化物酶活性。 化学修饰的方法为：首先用苯甲基磺酰氟特异性活化结合部位的Ser，然后用H2Se或NaHSe亲核取代，则将Ser转化为硒代半胱氨酸。,将辅酶

30、引入结构已明了的蛋白质上是制备半合成酶的又一策略。,例如，Kaiser等人的黄素木瓜蛋白酶。黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的Cys-25共价结合成黄素木瓜蛋白酶。此半合成酶的酶活性可与老黄素酶相比拟。 其它的辅酶，如维生素B1、吡哆醛、卟啉等都可以共价偶联到某些酶的结合部位，从而产生新的实用催化剂。,人们将血红蛋白和白蛋白修饰后产生了酶活性，而将细胞色素C水解后产生了过氧化物酶活性。,利用半合成酶方法不但可以制造新酶，还可获得关于蛋白质结构和催化活性间关系的详细信息，为构建高效人工酶打基础。,将抗体结合部位附近适当位置引入催化活性基团是构建半合成抗体酶的有效途径。 基本方法是用化学方法将一个催

31、化活性基团引入抗原类似物中。利用抗体与抗原类似物的亲和结合作用，使催化活性基团与抗体结合部位附近的氨基酸残基共价结合，将催化活性基团与抗原类似物分离，在结合部位附近就引入了活性基团，如-SH或咪唑基。,Schultz等人应用此方法已成功地将-SH引入到抗体MOPC315的结合部位附近。这种半合成抗体酶可提高硫解速率达6104倍。用同样的方法将咪唑基引入到抗体中，其结果是使水解速率明显提高。,Keyes等人描述了一种原则上可能普遍适用的分子印迹方法，它可以改变酶的底物专一性并创造出新酶。 方法先使酶或无活性蛋白变性，然后加入所希望酶活力的竞争性抑制剂或底物类似物印迹分子，待获得所希望的活性构象后

32、，用交联剂固定这个构象，除去抑制剂后，就产生了具有新的酶活的印迹酶,五、印迹酶 在分子水平上模拟酶对底物的识别与催化功能已引起各国科学工作者的广泛关注。自然界中，分子识别在生物体如酶、受体和抗体的生物活性方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相匹配的结合部位的存在。,为获得这样的结合部位，科学家们应用环状小分子或冠状化合物如冠醚、环番、环糊精、杯芳烃等来模拟生物体系。以一种分子充当模板，周围用聚合物交联，当除去模板分子后，此聚合物就留下了与模板分子相匹配的空穴。,如果构建合适，这种聚合物就象“锁” 一样对钥匙具有选择性识别作用。 通常将该技术称为分子印迹技术,到了二十世纪七、八十年代，分

33、子印迹技术获得了很大的突破，成功地制备出分子印迹聚合物。,经过二三十年的努力，分子印迹技术趋于成熟，并在分离提纯、免疫分析、生物传感器，特别是人工模拟酶方面显示出广泛的应用前景。,5.1 分子印迹原理 分子印迹实际上是指制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。通常将这一化合物称为印迹分子或者模板分子。分子印迹技术包括如下内容： 选定印迹分子和功能单体，使二者发生 互补反应； 在印迹分子单体复合物周围发生聚合 反应； 用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。,通过这样处理，形成的聚合物内保留有与印迹分子的形状大小完全一样的空穴，也就是说印迹的聚合物能维持相对于模板分子的互补性，因此，该聚合物就能以高选

34、择性重新结合模板分子。,分子印迹也叫主客聚合作用或模板聚合作用，实践上制备选择性聚合物并不难，仅涉及简单的众所周知的实验技术，其具体步骤如图所示，制得的聚合物就简称为印迹分子。,如果用一种纯对映体作为印迹分子，就能产生有效手性拆分外消旋物的印迹聚合物，此时，该印迹空穴具有不对称结构，而这种不对称是由于被固定的聚合物链的不对称构象所产生的。,一般来说，聚合物空穴对印迹分子的选择性结合作用来源于空穴中起结合作用的官能团的排列以及空穴的形状，关键的反应性官能团的排列在空穴特异性结合中起决定性作用，而空穴的形状在某种程度上却是次要因素。,模板分子与单体相互作用类型 模板分子与单体相互作用类型主要有两种

35、: 模板分子与单体通过共价可逆结合； 单体与印迹分子之间的最初反应是非共价的。,可逆共价结合可得到能拆分糖的外消旋混合物的聚合物,苯基D甘露吡喃糖苷作印迹分子，与单体乙烯基苯基硼酸发生作用,由于该聚合物可以可逆地、选择性地结合印迹分子，所以可拆分外消旋混合物,非共价相互作用的分子印迹,（a）苯丙氨酸酰苯胺（）和丙稀酸之间的离子或其他相互作用决定“印迹部位”的形状大小和性质。与交联并抽提模板分子后，该聚合物对苯丙氨酸酰苯胺有选择性。 （b）为在此聚合物层析柱上拆分外消旋的，苯丙氨酸酰苯胺。,影响印迹分子选择性识别的因素 影响印迹分子选择性识别的因素很多，主要有： 底物结构和互补性 聚合物与模板分

36、子间作用力 交联剂的类型和用量 聚合条件,底物结构和互补性： 底物必须与模板分子的结构大小相似，否则影响分辨力。不仅要求聚合物中存在与原来印迹分子在大小和形状上互补的部位（孔穴），更重要的是这些部位内的功能基团要排列正确，要有适当取向。,聚合物与模板分子间作用力： 聚合物与模板分子间的作用力强弱是影响识别力的重要因素。若能在二者间产生多种相互作用力，如离子键氢键等。而且键的数目又多，则会大大改善聚合物的识别能力。,交联剂的类型和用量： 聚合物的对映体选择性对聚合所用交联剂的类型和用量依赖性很大。交联少会降低聚合物的坚牢程度，难于限定负责选择性部位的形状和其中的基团取向，导致识别力下降。使用旋光

37、性交联剂，则可能造成与模板分子有附加的手性相互作用，提高识别力。,聚合条件： 低温聚合可以稳定模板分子和单体间的复合物，容许印迹热敏分子；同时还能改变聚合物的物理性质，可能增加制备较高分辨力聚合物的可能性。,5.2 分子印迹聚合物的制备方法 制备分子印迹聚合物的过程一般包括：a. 选定印迹分子和单体，让他们之间充分作用；b. 在印迹分子周围发生聚合反应；c. 将印迹分子从聚合物中抽提出去。,可用于分子印迹的分子很广泛，如药物、氨基酸、碳水化合物、核酸、激素、辅酶等,应用最广泛的聚合单体是羧酸类，如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸，磺酸类，以及杂环弱碱类如乙烯基吡啶、乙烯基咪唑。其中最常用的体系

38、为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系分子。,5.3 分子印迹酶,目前，人们已经利用分子印迹技术制备出了人工模拟酶，通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，同时在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。,产生底物结合部位并使催化基团与底物定向排列是获得高效人工模拟酶至管重要的两个方面。,但要想制备出具有酶活性的分子印迹酶，选择合适的印迹分子是相当重要的。目前，所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物以及产物等。,1 印迹底物及其类似物 酶的催化是从对底物的结合开始的，产生对底物的识别可促进催化。研究表明，以产物为印迹分子的印迹聚合物表现

39、出较高的酶催化效率，而以反应物为印迹分子的印迹聚合物催化相同的反应时却较低。 将催化基团定位在印迹空腔的合适位置对印迹酶发挥催化效率相当重要，可以通过相反电荷等的相互作用引入互补基团。基于非共价相互作用的分子印迹也可用来产生催化聚合物。,2 印迹过渡态类似物 与用过渡态类似物作模板分子制备的印迹聚合物也能结合反应过渡态，降低反应活化能，从而加速反应，如图。而这种速度加快可被过渡态类似物专一性抑制，从而证明所得到的速度加强完全是由分子印迹提供的专一结合部位引起的。,针对过渡态类似物对-硝基苯甲基磷酸酯制备的印迹聚合物能加速酯水解成相应的羧酸,利用分子印迹技术印迹过渡态类似物，产生了具有手性酯水解

40、能力的又一印迹酶。,该印迹聚合物模拟酶表现出对映体选择性水解能力，其对映体水解催化常数比 kD/kL为1.9。但同非印迹的聚合物相比，催化效率只提高了2.5倍，同含咪唑的溶液相比，催化效率也只提高了10倍,3 表面印迹过渡态类似物 表面分子印迹聚合物微胶可以克服由于印迹聚合物扩散慢而引起的动力学问题，人们试图利用表面印迹技术使载体表面印迹产生模拟酶的结合部位。,将胰蛋白酶水解反应的过渡态类似物，与长链烃经酰化制备成类似于表面活性剂的分子，并以此为模板与表面活性剂、硅氧烷、微胶粒混合在水/油型乳液中，过渡态类似物作为表面活性剂的亲水头在水相界面与硅氧烷、硅胶微粒通过氢键和疏水作用充分结合，待硅氧

41、烷聚合后, 印迹分子就定位在微胶表面。去除表面活性剂，在硅胶微粒表面就形成了与过渡态互补的微孔。实验研究表明，印迹酶具有酰胺水解活性。,已成功地模拟了许多酶，如酯水解酶、HF水解酶、葡萄糖异构酶等。有的甚至达到了天然酶的催化效率。,例1 酯水解生物印迹酶 选择吲哚丙酸为印迹分子，印迹牛胰核糖核酸酶，待起始蛋白质在部分变性条件下与吲哚丙酸充分作用后，用戊二醛交联固定印迹蛋白质的构象，经透析去除印迹分子后就制得了具有酶水解能力的生物印迹酶。,通过研究，已经知道，该印迹酶的最适pH、底物饱和特性以及产物抑制等均与天然酶类似，但却具有较宽的底物特异性。,对含芳环的氨基酸酯如色氨酸乙酯、苯醛-L-精氨酸

42、乙酯、酪氨酸乙酯等均表现出相当好的水解活性，而对非芳香氨基酸乙酯，如甘氨酸乙酯、赖氨酸乙酯等则表现出较低的催化活性。吲哚环诱导的芳香疏水结合部位对结合芳香基团的底物起到关键作用。,例2 HF水解生物印迹酶 氟水解酶是一类重要的酶，可催化含氟化合物的水解反应而使含氟有机磷和磺酸类化合物解毒。 最常见的底物包括二异丙基氟磷酸(DFP)、对甲苯基磺酰氟(PMSF)等。,有研究者以不同的底物类似物为印迹分子印迹核糖核酸酶，获得了具有高活力的氟水解酶，其催化DFP的活性比相应的抗体酶高10倍，甚至超过了某些天然酶的活力水平,例 3 具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的生物 印迹酶 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是

43、在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它以谷胱甘肽(GSH)为还原剂分解体内的氢过氧化物，因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化物损伤，对此酶的人工模拟具有重要的药用价值。,吉林大学的罗贵民等采用生物印迹方法产生GSH结合位点，再经过化学修饰引入含硒的基团SeCys，制备的印迹酶活力仅比天然酶低一个数量级。,模拟酶研究进展,人工模拟酶这一研究领域已引起各国科学家的极大关注。 世界发达国家，如美、德、日、英、法等都把模拟酶作为重点课题列入未来的研究计划,我国也将对模拟酶的研究列入国家自然科学基金重点资助的高技术、新概念、新构思探索性课题。,近年来，人们以酶结构知识，酶动力学研究为基础，采用多种新型

44、技术如抗体酶制备技术，在分子水平上模拟酶对底物的结合催化，取得了许多重要成果。,人工模拟酶的实践证明，利用环糊精、大环化合物、抗体、印迹蛋白等为基质已制备出大量的人工酶，部分人工酶的催化效率及选择性已能与天然酶相媲美。,但也应该看到，大多数人工酶的催化活性并不高，这主要是由于目前尚缺乏系统的、定量的理论为指导。另外的原因是，大多数人工酶模型过于简单，缺乏对催化因素的全面考虑。,近年来，生物印迹技术的出现为分子印迹酶的发展注入了新的活力，运用分子印迹技术对酶的人工模拟已成功地制备出具有酶水解、转氨、脱羧、酯合成、氧化还原等活性的分子印迹酶。,人工模拟酶的研究属于化学、生物学等领域的交叉点，属交叉学科。对酶的模拟已不是仅限于化学手段，基因工程、蛋白质工程等分子生物学手段正在发挥越来越大的作用。化学和分子生物学以及其它学科的结合使酶模拟更加成熟起来。,随着酶学理论的发展，人们对酶学机制的进一步认识，以及新技术、新思维的不断涌现，理想的人工酶将会不断产生。,