第六单元核酸2.ppt

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1、,第12章 核酸通论 第13章核酸的结构 第14章核酸的物理化学性质 第15章核酸的研究方法,1 核苷酸 2 核酸的共价结构,3 DNA的高级结构,4 RNA的高级结构,主要元素组成： C、H、O、N、P(911%) 与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,1 核苷酸,1.1 核酸的元素组成,1.2 核酸的基本构成单位：核苷酸(nucleotide),核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成,核酸与蛋白质一样，是一种高分子聚合物。它是由结构较简单的小分子有机化合物核苷酸组成。核苷酸是核酸的基本结构单位。,1.2.1 戊糖,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱

2、氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,核酸中的戊糖都是-D-型,嘌呤(purine),1.2.2 碱 基,嘧啶(pyrimidine),酮式烯醇式互变异构,大部分以酮式存在,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,1.2.3 核苷(ribonucleoside),核苷=戊糖+碱基,糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,碱基和核糖通过糖苷键连接形成核糖核苷。 碱基和脱氧核糖通过糖苷键连接形成脱氧核苷。,核苷中戊糖与碱基的连接方式：,嘌 呤,嘧 啶,核糖,脱氧核糖,嘧啶碱： C1-N1 嘌呤碱： C1-N9，,核糖核苷酸： AMP, GMP, U

3、MP, CMP 脱氧核糖核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,1.2.4 核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名,核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,核苷酸=核苷+磷酸 =戊糖+碱基+磷酸,2-核糖核苷酸 3-核糖核苷酸 5-核糖核苷酸,3-脱氧核糖核苷酸 5-脱氧核糖核苷酸,核糖核苷,脱氧核糖核苷,酸,酸,游离核苷酸多为5-核苷酸,1.2.5 核苷酸衍生物,(1)ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),含有两个高能磷酸键。ATP水解可以释放出大量自由能。 解释的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。能量转换中间体 ATP也是一种很好的磷酰

4、化剂。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,adenosine,(2)GTP (鸟嘌呤核糖核苷三磷酸),也是一种高能化合物。 GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下, ATP 和 GTP 可以相互转换。,(3) cAMP 和 cGMP,cAMP(3,5- 环腺苷酸)和 cGMP( 3,5-环鸟苷酸)的主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。,(4) 辅酶,维生素PP-尼克酰胺辅酶（辅酶I）,维生素B2-黄素辅酶,2 核酸的共价结构,2.1 核酸中核苷酸的连接方式 2.2 DNA的一级结构 2.3 DNA与基因组,2.1.1 核酸中核苷酸的连接方

5、式,核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。,C,G,A,3 -5 磷酸二酯键,2.1.2 多聚核苷酸的特点,在多聚核苷酸的连接方式通常称为3-5磷酸二酯键 多聚核苷酸链一端的C5带有一个自由磷酸基，称为5-磷酸端（常用5-P表示）；另一端C3带有自由的羟基，称为3-羟基端（常用3-OH表示）。 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53(由左至右)或是35。,由核糖核苷酸聚合而成的称为RNA； 由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为DNA。,DNA,How polynucleotides are actually formed,3-OH,5-dNTP,在多聚核

6、苷酸（DNA或RNA）链中，由于构成核苷酸单元的戊糖和磷酸基是相同的，体现核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基，所以多聚核苷酸链结构也可表示为：,2.1.3 核酸的表示方式,3,3,3,5,5,5,竖线代表戊糖碳链，P代表磷酸集团，与P相连的斜线带代表3-5磷酸二酯键,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,P为磷酸基团,DNA分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做DNA的一级结构，简称为碱基序列.,DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP连接起来的线形或环形多聚体。 连接键：3-5磷酸二酯键 磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架 碱基

7、形成侧链 走向规定为5 -3,DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,基因（gene）：生物细胞中DNA分子的最小功能单位。,2.3.1 DNA与基因,2.3 DNA与基因组,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息， 并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因组（genome）：某生物体所含全部基因。,Genome size,2.3.2 原核生物基因组的特点,（1）DNA大部分为结构基因，每个基因出现频率低。,（2）有基因重叠现象。,Expression of a

8、 bacterial operon. In this example, an mRNA encodes more than one peptide. Such mRNA is called polycistronic. Some bacterial mRNAs are polycistronic, but nearly all eukaryotic mRNAs are monocistronic (encodes a single peptide).,（3）功能相关基因串联在一起，并转录在同一mRNA中（多顺反子）。,（1）重复序列,单拷贝序列,：在整个DNA中只出现一次或少数几次，主要为编码

9、蛋白质的结构基因。,中度重复序列,：在DNA中可重复几十次到几千次。,高度重复序列,：可重复几百万次,2.3.3 真核生物基因组的特点,（2） 有断裂基因 由于基因中内含子的存在,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)没有内含子。,3 DNA的高级结构,3.1 DNA的二级结构 3.2 DNA的三级结构 3.3 DNA与蛋白质复合物的结构,1) DNA碱基组成分析,20世纪40年代chargaff规则, DNA碱基组成有种的特异性，但没

10、有组织、器官特异性。, A=T；G=C；A+C=T+G; A+G=T+C;,3.1.1 提出DNA双螺旋结构模型的根据,3.1 DNA的二级结构,-NH2,-C=O,嘌呤,嘧啶,碱基的理化数据分析,计算出A-T、G-C以氢键配对较合理。Pauling 和Corey发现A与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。,2) DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析（Franklin）,3) 已知核酸的化学结构： 磷酸、戊糖、含氮碱基,3.1.2 DNA的二级结构的发现 1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。,3.

11、1.3 DNA双螺旋结构的特点,DNA分子由两条DNA单链组成。 DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA的双螺旋模型特点,（1）两条反向平行的多聚核苷酸链沿一个假设的中心轴右旋相互盘绕而形成。螺旋表面有大沟和小沟。,大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间,而大沟位于相毗邻的双股之间。,大沟,小沟,（2）磷酸和脱氧核糖单位作为不变的骨架组成位于外侧，糖环平面与纵轴平行；作为可变成分的碱基位于内侧，碱基平面与纵轴垂直。链间碱基按AT，GC配对（碱基配对原则，Chargaff定

12、律）,DNA的双螺旋模型特点,（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，螺旋结构每隔10个碱基对（base pair, bp）形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm。,DNA的双螺旋模型特点,（4）维持两条DNA链相互结合（横向）的力是链间碱基对形成的氢键。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。 碱基堆积力维持双链螺圈之间（纵向）稳定性。,DNA的双螺旋模型特点,T,A,G,C,DNA的双螺旋模型特点,（5）碱基在一条链上的排列顺序不受限制，而在另一条链上要遵循碱基配对原则，为第一条链的互补链。 表明遗传信息有碱基序列携带

13、。,3.1.4 DNA双螺旋的种类,Watson Crick DNA双螺旋结构（B型DNA）,当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时， DNA的构象发生改变。,不同DNA纤维的空间结构,B-DNA：92%相对湿度，接近细胞内的DNA构象，与Watson 和Crick提出的模型相似。,A-DNA：75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似，推测转录时发生BA。其碱基平面倾斜20，螺距与每一转碱基对数目都有变化。,Z-DNA：主链呈锯齿型左向盘绕，直径约1.8nm，螺距4.5nm，每一转含12个bp，只有小沟。B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因的调控有关。Z-DNA为左手螺

14、旋。,C-DNA：4446%相对湿度，螺距3.09nm，每转螺旋9.33个碱基对，碱基对倾斜6。可能是特定条件下B-DNA和A-DNA的转化中间物。,D-DNA：60%相对湿度，DNA中A、T序列交替的区域。每个螺旋含8个bp，螺距2.43nm，碱基平面倾斜16。,Comparison between B form and Z form,双螺旋DNA的结构参数,DNA变构效应可能与基因表达调控有关,DNA三股螺旋,-,-,-,-,-,DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。 第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关

15、遗传信息的表达。,碱基堆积力（base stacking force），由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素； 碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。 磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。 DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,3.1.5 DNA双螺旋的稳定性,3.1.6 DNA的双螺旋结构的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录

16、的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是20世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,超螺旋,螺旋,三级结构是指DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的特定构象。,超螺旋是DNA三级结构的主要形式。,3.2 DNA的三级结构,1965年Vinograd等用电镜发现SV40和多瘤病毒的环形DNA的超螺旋。,Relaxed and supercoiled DNA molecules,共价闭合环状DNA 开环DNA 线型DNA,L=23,T=23,W=0,解链环形,1,5,10,15,20,23,DNA超螺旋的形成,超螺旋的方向,

17、The supercoils introduced by underwinding are called “negitive”, while the supercoils introduced by overwinding are called “positive”.,天然环状DNA一般都以负超螺旋构象存在,超螺旋：解除外力捻转造成的胁变 正超螺旋：在外力往紧缠的方向捻转时产生。 负超螺旋：在外力向松缠的方向捻转时产生。, 使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中； 推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。,3.3 DNA与蛋

18、白质复合物的结构,生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白（nucleoprotein）的形式存在。 DNA分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中。,3.3.1 病毒,噬菌体T2结构,动物病毒切面模式图,被膜（脂蛋白、碳水化合物）,衣壳（蛋白质）,核酸,突起（糖蛋白）,病毒粒,DNA-蛋白质核心,突环由双链DNA结合碱性蛋白质组成,平均一个突环含有约40kpDNA,3.3.2 细菌的拟核,细菌拟核（nucleoid ）的突环结构,3.3.3 DNA在真核生物细胞核内的组装,核小体(nucleosome)： 由DNA和组蛋白构成。,DNA：以负超螺旋缠绕在组蛋白上,组蛋白核

19、心：H2B ,H2A ,H3 ,H4,H1组蛋白在核小体之间,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA （2nm）,核小体链（ 11nm，每个核小体200bp）,纤丝（ 30nm，每圈6个核小体）,突环（ 150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（ 300nm ，6个突环）,螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（ 1400nm， 每个染色体含10个螺旋圈,Human Karyotype using fluorescent staining,4 RNA的高级结构,4.1 RNA的一般结构特征和类型 4.2 tRNA 4.3 rRNA 4.4 mRNA和hnRNA 4.

20、5 snRNA和siRNA 4.6 RNA的其它功能,RNA分子中核苷酸之间的连接方式,AMP、GMP、CMP、UMP通过3-5磷酸二酯键形成的线形多聚体。,4.1 RNA的一般结构特征和类型,4.1.1 RNA的一般结构特征,1) 组成RNA的核苷酸中的糖单位是核糖 2) RNA的碱基中没有胸腺嘧啶，而有U尿嘧啶。 3) 除了在某些病毒中RNA以双链存在以外，RNA分子都是单链。因此，RNA分子中没有DNA分子中存在的碱基互补配对规律，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。 4) 在RNA分子中存在由同一条链折叠而成的发夹状双链区。在这些区域中，A与U配对，C与G配对。但是这种配对常常是不完善的，

21、有些部分不能形成配对，就向外呈环状突起(loop)。,1) 转移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。 2) 核糖体RNA（ribosoal RNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成的场所； 3) 信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用；,4) 其它类别的RNA,（1）病毒RNA（Viral RNA, rRNA）,（2）核内RNA（nuclear RNA, nRNA）, 不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）, 小分子核RNA

22、（small nuclear RNA, sn RNA）, 小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA）, 染色体RNA（chromosomal RNA, ch RNA）,（3）线粒体RNA（mitochondrial RNA, mit RNA）,（4）叶绿体RNA（chloroplast RNA, chlRNA或ctRNA）,3,5,1965年,4.2 tRNA,tRNA约占总RNA的1015， Mr较小（Mr25000），沉降常数4S。 tRNA分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半不变的） tRNA有很多种类，已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRN

23、A。 tRNA分子的大小很相似，链长一般在7388个核苷酸之间，最长的有93个核苷酸。,从tRNA的结构中可以看到在链内部有很多配对的部分形成局部的双链结构，不配对的部分形成突环结构。,4.2.1 tRNA的二级结构,tRNA的二级结构都呈” 三叶草” 形状， 1） 氨基酸臂 包含有tRNA的3-末端和5-末端， 3-末端为CCA-OH，氨基酸可与其成酯，在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。,2） 反密码环 一般含有7个核苷酸残基，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码子,反密码子与mRNA相互作用,Pairing between tRNAs anticodon and mRNAs codon. T

24、he left figure defines the wobble position where base pairing does not obey the standard rule. The right tables show all possible base pairings at the wobble position. For example, guanine (G) can pair with both cytosine (C) and uracil (U) ; inosine (I) can pair with cytosine, adenine and uracil.,3）

25、二氢尿嘧啶环(D) 含有二氢尿嘧啶。识别氨酰-tRNA合成酶 4） TC环 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。识别核蛋白体（核糖体）,5）额外环（可变区） 不同的tRNA该区变化较大，3-18b，是tRNA的分类指标之一 。 6）含有修饰碱基和不变核苷酸。,1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。,近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构

26、均为倒L型,4.2.2 tRNA的三级结构,转运氨基酸 识别密码子 参与翻译起始 参与DNA的反转录 参与基因表达调控,4.2.3 tRNA的功能,4.3.1 rRNA,rRNA约占全部RNA的80，与蛋白质（40%）共同组成核糖体。由于核糖体是蛋白质的合成场所，因此rRNA必然与蛋白质的生物合成有密切的关系。 23SrRNA具有催化肽键形成的转移酶活性。参与tRNA与mRNA的结合。 rRNA为单链结构。原核细胞中的rRNA有3种，真核细胞中的rRNA有4种。,原核生物核糖体,70S,50S,30S,5S rRna 23S rRNA,34种蛋白质,16S rRNA,21种蛋白质,80S,60

27、S,40S,5S rRNA 5.8S rRNA 28S rRNA,49种蛋白质,18S rRNA,33种蛋白质,真核生物核糖体,4.3.2 rRNA的种类（根据沉降系数）,4.4 mRNA和hnRNA,约占总RNA的5左右，为单链结构，不同细胞的mRNA链的长度和相对分子量的差异很大。 mRNA的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质的合成场所核糖体上。新合成的肽链的氨基酸顺序即根据mRNA所传递的信息来决定的。,真核细胞,4.4.1 mRNA的结构,真核生物mRNA特征：单顺反子，断裂基因 “帽子”（m7G-5ppp5-N-3p）+单顺反子+“尾巴”（Poly A） 原核生物mRNA特征：多顺

28、反子 先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列,内含子 (intron),外显子 (exon),4.4.2 真核生物mRNA成熟过程,断裂、修剪、修饰,细胞核,细胞质,* 真核生物mRNA的结构特点,1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2. 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构： 由甲基化酶催化； 可抵抗5核酸外切酶降解mRNA； 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。 多聚A尾： 转录后由poly(A)聚

29、合酶催化加尾； PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式； polyA与mRNA半寿期有关， PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。,原核细胞mRNA的结构特点,由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5帽子和3polyA。 SD序列：5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。 SD序列与翻译起始有关，是核糖体小亚基16SrRNA结合的部位。,4.5 snRNA和siRNA,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA， snRNA主

30、要存于细胞核中，占细胞RNA总量的0.11%，与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。,小片段干扰RNA （siRNA；又称“引导RNAs”，guide RNAs）： 一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。,4.6 RNA的其它功能,1981年，Cech发现RNA的催化活性，提出核酶,大部分核酶参加RNA

31、的加工和成熟，也有催化C-N键的合成。23SrRNA具肽酰转移酶活性。,RNA在DNA复制、转录、翻译中均有一定的调控作用，与某写物质的运输与定位有关。,RNA组学研究细胞中RNA的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下RNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学:,1 核酸的理化性质 2 核酸的水解 3 核酸的酸碱性质 4 核酸的紫外吸收 5 核酸的变性，复性及杂交,1 核酸的理化性质,核酸的两性性质及等电点： 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为44

32、.5，RNA的等电点为22.5。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。,性状：DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。 粘度：DNA粘度极高，也极易在机械力作用下折断。双链DNA解链成为单链DNA时，粘度下降。而RNA溶液要小得多。 溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水， 但它们的钠盐在水中溶解度较大。 稳定性：RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。,2 核酸的水解,2.1 酸水解,糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键,利用酸水解可以研究核酸

33、的碱基组成,2.2 碱水解,RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.31mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。 DNA抗碱水解 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,2.3 酶水解,非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸 特异的磷酸二酯酶： 核酸酶,磷酸二酯酶,N-糖苷酶,作用于DNA、RNA,2.3.1 核酸酶的分类,底物专一性： 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase 作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、核

34、酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 磷酸二酯键的断裂方式： 3-OH 切断 产生5-（寡）核苷酸 5-OH 切断 产生3-（寡）核苷酸,2.3 酶水解,2.3.2 核糖核酸酶RNAase RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2,耐热，高度专一的内切酶 作用位点：嘧啶核苷-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键 产物：3-嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。 RNase T1 耐热、耐酸 产物：3-鸟苷酸或以其为结尾的寡核苷酸，专一性更高 RN

35、ase T2 产物：将tRNA完全水解为以3-腺苷酸结尾的寡核苷酸,2.3.3 脱氧核糖核酸酶DNase,牛胰脱氧核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA，产生以5-磷酸为末端的寡核苷酸 牛脾脱氧核糖核酸酶，DNase 产生以3-磷酸为末端的寡核苷酸,DNA限制性内切酶,核酸酶S：作用于单链DNA部分,链球菌脱氧核糖核酸酶 产生长度不一的5- 磷酸为末端的碎片,原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonucle

36、ase）。,回文序列又叫反向重复序列,序列旋转180 后还是一样； 两条链从 5 到 3 方向的序列一致；是自我互补的序列 ；,“Able was I ere I saw Elba” 在我看到厄尔巴岛之前，我曾所向无敌。,酶,辨认的序列和切口,说明, A G C T T C G A , G G A T C C C C T A G G , A G A T C T T C T A G A , G A A T T C C T T A A G , A A G C T T T T C G A A , G T C G A C C A G C T G , C C C G G G G G G C C C ,B

37、am H I,Alu I,Bgl I,Eco R I,Hind ,Sal I,Sma I,四核苷酸，平端切口,六核苷酸，平端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,I型：分子量大于105，多亚基，需S-线苷蛋氨酸、ATP和Mg2+ ，识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限制与修饰相排斥的多功能酶.,型：分子量小于105，需Mg2+ ，切割位点位于识别 位点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物学研究所用的限制性内切酶均为此类。,型：识别位点为5-7bp的非对称序列 ，切割位点在顺序之外离识别 序列5-10bp，

38、切割双链，个别也切割单链。是限制与修饰相竞争的多功能酶.,例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶,限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。,限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例：,3 核酸的酸碱性质,核酸能发生两性解离。 DNA等电点 44.5 RNA等电点 22.5 碱基的解离：碱性解离和酸性解离 核苷的解离：糖环影响碱基的解离 核苷酸的解离：磷酸基团使核苷酸具有较强的酸性,嘧啶,4 核酸的紫外吸收,核酸的碱基具有共轭双

39、键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰。可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光。,EB与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性 可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA） 可以嵌入碱基分子中，导致错配 并不能进入通过皮肤进入细胞内。 。,核酸的凝胶电泳,紫外分光光度法的应用,首先根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度,纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）,纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值

40、算出其含量,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,或相当于20g/ml寡核苷酸。,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。双链、单链DNA与核苷酸的紫外吸收之比是1:1.37:1.6,5 核酸的变性，复性及杂交,核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。 磷酸二酯键断裂称作核酸降解。 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,5.1 变性,5.1.1 变性概念,Denatura

41、tion of DNA,变性表征： 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加 变性因素： 妨碍碱基堆积力和增加静电斥力。pH（11.3或5.0）、 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）、低离子强度、 加热,结构：螺旋线团,理化性质：紫外吸收 粘度比旋光度,生物活性：生物活性或丧失,5.1.2 热变性和Tm,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。,融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中， DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为该DNA得

42、熔点或熔解温度（Tm）,1） Tm的大小与DNA分子中（G+C）的百分含量成正相关，测定Tm值可推算核酸碱基组成及判断DNA纯度。,经验式: (G+C)%=(Tm-69.3)2.44,Poly d(A-T),DNA,Poly d(G-C),某些DNA的Tm值,5.1.3 影响Tm的因素,3）介质中离子强度 离子强度高，Tm高。,大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线,2）DNA均一性 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。,5.2 复性,5.2.1 复性过程,理化性质: 比旋光度 粘度,复性

43、 也称退火 （annealing）,生物活性得到部分恢复，具有减色效应。,变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”,5.2.2 影响复性速度的因素：,（1）单链片段浓度,（2）单链片段的大小,（3）重复序列的多少,（5）溶液温度的高低T 25,（4）维持一定的溶液离子强度,5.3 核酸的杂交,在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程叫做分子杂交。,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,有碱基配对的区域,不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在适宜的条件（温度及离子强度）下，在

44、复性时可形成局部双螺旋区，就可以在不同的分子间形成杂化双链,探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。,原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。,点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。,Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,Western印迹法：将电泳分离后的蛋白吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。探针是抗体。,核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 确定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样

45、品中存在与否 是基因芯片技术的基础 特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等,多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Polymerase: DNA聚合酶,基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science

46、杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B. Mullis（1944）,http:/,三篇重要论文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 ) Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):48

47、7-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 ),生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,限制性内切酶裂解,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,基因组DNA文库,DNA文库,20kB fragments,插入噬菌体载体,细菌扩增,裂解变性,显影,从基因组文库中筛选目的基因,probe,放射性核素 标记,转印,DNA克隆,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取DNA分子,DNA聚合酶,引物,引物,1977年,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,72,94,55,PCR循环,PCR技术的原理,1 PCR技术的基