生物化学第一章蛋白质.ppt

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1、第一章蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,Protein,一：蛋白质概述 二：氨基酸 三：肽与肽键 四：蛋白质的分子结构 五：蛋白质的分子结构与功能关系 六：蛋白质的重要性质 七：蛋白质的分类,1.蛋白质？,蛋白质： Pr(Protein)是以氨基酸为组成单位的经肽键连接 而成的结构复杂的生物高分子。,Protein： A word coined by Jons J. Berzelius in 1838 to

2、emphasize the importance of this class molecules. Derived from the Greek word proteios,which means “of the first rank.”,一、蛋白质概述,“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断地自我更新”。 恩格斯反杜林论(1878年) 蛋白体核酸Pr （结合蛋白质:核蛋白）,2.蛋白体？,含量多： 湿重：约占体重的1722% ； 干重：约占细胞干重45%,3. 为什么说：蛋白质是生命的物质基础？,种类多：一个大肠杆菌：3000种 一个真核细胞：数千种

3、 人体内蛋白质： 10万种 生物界： 约1百亿种,主要表现在： 参与构成各种细胞及组织 参与体内的物质代谢、细胞信号的转导 及生理功能的调节控制 特殊功能: 催化、运输、储存、凝血与 纤溶、识别、免疫等等 氧化供能: 17.15kJ/g蛋白质,功能多：,参与物质代谢调控：蛋白激酶A,蛋白激酶C,磷酸化酶a, 钙调蛋白,G蛋白,腺苷酸环化酶等。 参与生理功能调控： 多种生长因子，如表皮生长因子等 蛋白质类激素，如胰岛素等。 参与基因调控： 组蛋白、非组蛋白、阻遏蛋白、 基因激活蛋白等。,调控功能：,二.蛋白质的分子组成,元素组成：,1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元

4、素。,碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 04 其他 微 量(磷、铁、碘、锌和铜),2、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为16%。 3、定氮法测定蛋白质含量： 蛋白质含量6.25样品含氮量,应用：微量凯氏定氮法,凯氏定氮法,实验原理：蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。,微量凯氏定氮装置 1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a； 4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、

5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。,三、蛋白质的基本结构单位氨基酸,(一)、 氨基酸的通式 (二)、二十种常见的蛋白质氨基酸分类、结构及三字符号 (三)、氨基酸的性质,蛋白质水解,蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.,完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。 所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。,1.氨基和羧基的位置: 分为-、-氨基酸等. 2.连接在手性碳原子

6、上各原子或基团在空间分布 分为L-氨基酸或D-氨基酸. 3.氨基的不同, 分为氨基酸和亚氨基酸 4.是否有密码：编码和非编码氨基酸,分类与依据：,20种氨基酸,(一)、氨基酸的结构,氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为 -氨基酸,COOH H2N CH -碳原子基团 R R基团,-氨基酸基本结构通式,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据,手性碳原子：连接四个

7、不同的原子或基团。 手性分子：与自身镜像不能重叠的分子。 旋光度：偏振光旋转的角度。 比旋光度：,：旋光度,：质量浓度(g/ml),：测定时的温度,：光源的波长,：盛液管的长度（dm）,构型和命名法,D,L-构型表示法： 羟基在碳链右边的为 D 型，它的对映体为 L 型。,D-甘油醛 L-甘油醛,凡可以从D-甘油醛通过化学反应而得到的化合物，或可以转变成D-甘油醛的化合物， 都具有与D-甘油醛相同的构型，即D型。与L-甘油醛的相同构型的化合物则是L型。,除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。,各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。,-氨基酸,可变部分,不变部分,Amino acid,氨基酸

8、的结构,甘氨酸 Glycine,（1）中性氨基酸,1、脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,（1）中性氨基酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine,（1）中性氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine,（1）中性氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine,（1）中性氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸

9、Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 甲硫氨酸 Methionine,（2）含硫氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 甲硫氨酸 Methionine 半胱氨酸 Cysteine,（2）含硫氨基酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine,（3） 含羟基氨基酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,（3）含羟基氨基酸,氨基酸的结构,（4）碱性氨基酸,精氨酸 Arginine,氨基酸的结构,（4）碱性氨基酸,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Ly

10、sine,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate,酸性氨基酸,（5）酸性氨基酸及其酰胺,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,酸性氨基酸,（5）酸性氨基酸及其酰胺,氨基酸的结构,天冬酰胺 Asparagine,含酰胺氨基酸,（5）酸性氨基酸及其酰胺,氨基酸的结构,天冬酰胺 Asparagine 谷氨酰胺 Glutamine,含酰胺氨基酸,（5）酸性氨基酸及其酰胺,氨基酸的结构,2、芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨

11、酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine 色氨酸 Trytophan,氨基酸的结构,碱性氨基酸,组氨酸 Histidine,3、杂环氨基酸,氨基酸的结构,脯氨酸 Proline （-吡咯烷基-羧酸）,亚氨基酸,组氨酸 Histidine,3、杂环氨基酸,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,组氨酸 Histidine 脯氨酸 Proline 色氨酸 Trytophan,3、杂环氨基酸,甘氨酸 （Gly,G）,丙氨酸 （Ala,A）,缬氨酸 （Val,V）,亮氨酸 （Lue,L）,异亮氨酸 （Ile,I）,中性脂肪族氨基酸,含羟基或硫脂肪族氨基酸,丝氨酸 （Ser,S）,苏氨酸 （Thr,

12、T）,半胱氨酸 （Cys,C）,甲硫氨酸 （Met,M）,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸 （Asp,D）,谷氨酸 （Glu,E）,天冬酰胺 （Asn,N）,谷氨酰胺 （Gln,Q）,碱性氨基酸,赖氨酸 （Lys,K）,精氨酸 （Arg,R）,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 （Phe,F）,酪氨酸 （Tyr,Y）,色氨酸 （Trp,W）,杂环氨基酸,组氨酸 （His,H）,脯氨酸 （Pro,P）,20种氨基酸的名称及缩写代号,几种重要的不常见氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。 这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。 其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、

13、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。,(二)氨基酸的分类,据R基团化学结构分类,脂肪族A（中性、含羟基或硫、酸性、碱性）,芳香族A(Phe、Tyr，Trp),杂环(His、Pro 、Trp),据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团AA（9种）,不带电荷（6种）,带电荷：正电荷（种）负电荷（种）,据氨基、羧基数分类,一氨基一羧基,一氨基二羧基(Glu、Asp),二氨基一羧基(Lys、His、Arg),人的必需氨基酸 Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr Arg、His,蛋白质基本结构单位：L氨基酸 氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）

14、除外 L氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外 氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH 常见氨基酸种类：20种。,小结,2、氨基酸分类：按其侧链的结构和理化性质分类,非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)： Ala, Val, Leu, Ile（支链）；Gly（无旋光异构）；Met（含硫）；Phe ,Trp （芳香族）；Pro（亚氨基） 极性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸) ： Ser, Thr（含羟基）；Tyr（芳香族）；Cys（含巯基）；Gln, Asn（含酰胺）,酸性氨基酸（含有两个羧基）： Glu（含羧基）、Asp（含羧基） 碱性氨基酸（含有两个以上氨基）： Arg（胍基）、His（咪唑

15、基）、Lys（氨基）,含硫氨基酸：Met、Cys 芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp,据R基团化学结构分类,脂肪族A（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）,芳香族A(Phe、Tyr，Trp),杂环(His、Pro 、Trp),据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团AA（9种）,不带电荷（6种）,带电荷：正电荷（种）负电荷（种）,(三)氨基酸的性质,1一般物理性质 2两性解离和等电点 3重要化学反应 与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定. 与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。 与

16、茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定 与甲醛反应：测定蛋白质的水解速度,1.一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异,溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。 (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。 (5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，

17、但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,氨基酸的紫外吸收,芳香族氨基酸的紫外吸收,大多数蛋白质均含有Tyr、Trp和Phe残基，因其结构上含有共轭双键苯环，在 280nm处有最大吸收峰。利用紫外分光光度法，可测定蛋白质含量。,2 氨基酸的解离性质和等电点,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,PH 1 7 10 净电荷 +1 0 -1

18、 正离子 两性离子 负离子 等电点PI,氨基酸的等电点（isoelectric point, pI）,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。 在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。,带电状态判定 pHpI .带负电 pHpI .不带电 pHpI .带正电,等电点计算 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2) 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸(Glu

19、、Asp)及Cys：pI=(pK1+pK2) 碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=(pK2+pK3),3,氨基酸的化学性质,1,(1)与茚三酮反应,-氨基和羧基共同参与的反应,茚三酮,水合茚三酮,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,水合茚三酮在弱酸中与-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，变成醛, 最后，水合茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应，生成蓝紫色物质。（max=570nm）,茚三酮反应-显色反应,例外：Pro黄色

20、,反应特点 A.为- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。 应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A.与甲醛反应，NaOH滴定, 终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 B.释放一个氢离子，相当于一个游离氨基（摩尔比1：1） C.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,(2)与甲醛反应,3.与2,4一二硝基氟苯(DNFB) 反应 （sanger反应）,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,DNP-AA(黄色),+,+ HF,氨基酸,反应特点 A.为- NH2的反应 B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)

21、C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸 应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 B.酸水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,4.与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应 （Edman反应）,PITC（phenylisothiocyanate）,+,苯硫乙内酰脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）,PTC-AA,Edman （异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析

22、法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,由Edman于1950年首先提出 为- NH2的反应 用于N末端分析，又称Edman降解法,PITC反应,肽链（N端氨基酸）与PITC反应，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定 用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链 灵敏度提高，能连续测定。 多肽顺序自动分析仪 样品最低用量可在5pmol,Edman降解法的改进方法- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲氨基

23、萘磺酰氯)测定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量,（5）与荧光胺的反应 - NH2的反应 氨基酸定量,（6）与5,5-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应 -SH的反应 测定细胞游离- SH的含量,（7）其他反应 成盐、成酯、成肽、脱羧反应,氨基酸的性质,两性解离和等电点 重要化学反应 与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定. 与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白N-端测定，

24、蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。 与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定 与甲醛反应：测定蛋白质的水解速度,氨基酸的应用,1，医药工业 氨基酸输液 必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸 半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸是幼儿所必需的。,治疗药剂,1，精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果； 2，天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。 3，半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等； 组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。,2，化学工业,维生素B6:可采用丙氨酸

25、或天冬氨酸为原料合成。 叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。 氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基-L-赖氨酰-L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。 聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。,3，食品工业,营养强化剂； 谷氨酸钠味精； 天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口； 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素APM,4，农业,杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强

26、的杀蚜虫和杀螨效果； 杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等； 除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；,5，化妆品工业,氨基酸能调节皮肤pH的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。 防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。 在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。,四 多肽,1、连接方式：肽键 肽键(peptide bond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基脱水而成的酰胺键称为肽键。（CONH） 肽平面(pepti

27、de unit)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。（CCONHC）,2、肽分类、命名,肽的命名：,按参与的AA残基：N端起 酰 酰 酸 按其功能： 如:催产素（9肽）、抗利尿激素（9肽） 按其来源：胰岛素；环状短杆菌肽 按来源加功能：胰高血糖素（23肽）,书写方式,三字母缩写：H Ala cys val OH,一字母缩写：,H A C V OH,中文第一个字： H 丙 半 缬 OH,完全方式：如：牛催产素,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,四肽的结构,3、生物活性肽： 谷胱甘肽 神经肽：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、P物质、Y肽 肽类激素：催产素、加压素等 其他：生长因子；短杆菌S

28、；甜味肽等,谷胱甘肽（GSH）,全称：-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。 其巯基可氧化、还原，故有还原型 （GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。,- 羧基,肽键,肽键,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,抗菌肽 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 细菌分泌的多肽，含有D-Phe和鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。,合成部位：下丘脑 化学本质：三肽（见下页图） 生理功能： a.促进腺垂体分泌促甲状腺素，后者促进甲状 腺细胞

29、增生、合成并分泌甲状腺激素 b.可促进生乳素、催产素和降压素的分泌 c.可影响大脑的机能，如抗抑郁、改变睡眠觉 醒和行为,促甲状腺素释放激素(TRH),-促黑素(-MSH）,分泌：腺垂体 本质：13 肽,生理功能： 能促进皮肤黑色素的合成 在两栖类和某些鱼类还可使黑色素细胞内聚集的黑色素 分散布满细胞及其突起，使皮肤变深。,神经肽：在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。 脑啡肽、-内啡肽、强啡肽、孤啡肽,神经肽,Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Leu-脑啡肽 H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-,氨基酸的等电点（isoelectr

30、ic point, pI）,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。 在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。,带电状态判定 pHpI .带负电 pHpI .不带电 pHpI .带正电,等电点计算 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2) 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=(pK1+pK2) 碱性氨基酸(赖、精、组)：p

31、I=(pK2+pK3),氨基酸的性质,重要化学反应 与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定. 与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。 与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定 与甲醛反应：测定蛋白质的水解速度,五、 蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,示例,虾红素,木瓜蛋白

32、酶,组织蛋白酶,蛋白质结构 的主要层次,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,primary structure,secondary structure,Tertiary structure,quaternary structure,（一）、蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目. 多肽链的氨基酸顺序， 以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,一级结构体现生物信息：20n .多样 一级结构是空间结构及生物活性的基础特异 一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键,在多肽链中，

33、氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,肽键、肽 氨基酸残基 蛋白质一级结构 一级结构的连接键,蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,一级结构测定,基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法,蛋白质顺序测定

34、基本方法路线,测定步骤,(1)，多肽链的拆分，测定多肽链数目。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(2)，二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，

35、用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,二硫键的断裂,(3)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(4)分析多肽链的N-末端和C-末端,蛋白质一级结构的测定,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端基氨基酸测定,多肽N、C-末端氨基酸的测定,N端 Sanger法（二硝基氟苯反应） DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（异硫氰酸苯脂反应） 氨肽酶法 C端 肼

36、解法 还原法 羧肽酶法,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端基氨基酸测定, 二硝基氟苯（DNFB）法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端基氨基酸测定, 丹磺酰氯法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水

37、解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端基氨基酸测定, 氨肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,末端基氨基酸测定,羧肽酶法,测定步骤,(5)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定,

38、多肽链的部分裂解,酶解法：如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 化学法：如溴化氰法 羟胺法,消化道内几种蛋白酶的专一性,（Phe.Tyr.Trp）,（Arg.Lys）,（脂肪族）,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶,（Phe. Trp）,2，测定步骤,(6)测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,Edman（异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman氨基酸顺序分析法,一般测定步骤,(7)确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，

39、拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意,所得资料： 氨基末端残基 H 羧基末端残基 S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO,借助重叠肽确定肽段次序：,末端残基 H S 末端肽段 HOWT APS 第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序 HOWTOUSEO VERLAPS,一般测定步骤,(8)确定原多肽链中二硫键的位置,蛋白质一级结构的测定,蛋白质测序的一般步骤,（1）拆分蛋白质分子中的多肽链，

40、 测定多肽链数目。 （2） 测定多肽链的氨基酸组成。 （3） 断裂链内二硫键。 （4） 分析多肽链的N末端和C末端。 （5） 多肽链部分裂解成肽段。 （6） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （7） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （8） 确定多肽链中二硫键的位置。,蛋白质（纯）,测定分子量，估计AA残基数（除120）,氨基酸自动分析仪 测定AA数量、种类和比例,肽链拆开,肽链末端分析,肽链选择性裂解,肽段分离,凝胶过滤 离子交换层析,氨基酸顺序分析：Edman法（异硫氰酸苯降解法）；酶解法,多肽链中氨基酸序列分析 的 主要步骤,（二）蛋白质的空间结构,蛋白质的构象（conformation）：指蛋白质分

41、子中所有原子的三维空间排列分布和肽链的走向。,肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,酰胺平面与-碳原子的二面角（ 和 ）,二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称角，绕C-C键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。,完全伸展的多肽主链构象,-碳原子,酰胺平面,=1800，=1800,=00，=00的多肽主链构象,酰胺平面,=00，=00,侧链,非键合原子接触半径,蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链主

42、链的折叠及盘绕方式。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 主要有-螺旋、-折叠、-转角。,1蛋白质的二级结构,（1）-螺旋 -helix,在-螺旋中肽平面的键长和键角一定； 肽键的原子排列呈反式构型； 相邻的肽平面构成两面角；,主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋； 螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm, 两个氨基酸之间的距离为0.15nm; 相邻螺旋圈之间形成链内氢键,氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的-NH 基与前面第四个氨基酸残基的-CO基形成氢键。 氨基酸残基侧链伸向外侧。,（1）-螺旋,-螺旋,影响-螺旋形成的因素主要是： 存在侧链基团较大的氨基酸残

43、基； 连续存在带相同电荷的氨基酸残基； 存在脯氨酸残基。,（2）-折叠,其结构特征为： 若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片； 所有肽键的C=O和NH形成链间氢键； 侧链基团分别交替位于片层的上、下方。,-pleated sheet,-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。 -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,-折叠,卷发(烫发)的生物化学基础,永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineerin

44、g),角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。 这是因为角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在构象状态，此外角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。,（3）-转角 -turn,多肽链180回折部分，通常由四个氨基酸残基构成，借1、4残基之间形成氢键维系。 这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,肽链主链出现的180回折部分称-转角。,（4）无 规 则 卷 曲,无规则卷曲,细胞色素C的二级结构,2、超二级结构、结构域,超二级结构( supersecondary struct

45、ure ),（1）在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。,（2）类型：、锌指结构、亮氨酸拉链,超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域,超二级结构类型,1 2 3 4 5,5 2 3 4 1,-链, -迂回,回形拓扑结构,回形拓扑结构, -迂回,螺旋区-回折-螺旋识别特定的DNA碱基序列,COOH,NH2,识别螺旋,锌指（Zine Finger）基元,EF手图象(钙调蛋白的钙结合位点的螺旋区-泡区-螺旋区结构),Ca2+,E helix,F helix,E,F,主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；

46、 螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm, 两个氨基酸之间的距离为0.15nm; 相邻螺旋圈之间形成链内氢键,氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的-NH 基与前面第四个氨基酸残基的-CO基形成氢键。 氨基酸残基侧链伸向外侧。,（1）-螺旋,（2）-折叠,其结构特征为： 若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片； 所有肽键的C=O和NH形成链间氢键； 侧链基团分别交替位于片层的上、下方。,-pleated sheet,结构域 (structure domain),结构域: 在二级结构及超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，是相对独立的紧密球状实体。 多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。 现在,结构域的概念有三种不同而又相互联系的涵义:即独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位。,类型： -螺旋域； -折叠域； +域； /域；无规则卷曲+-回折域；无规则卷曲+ -螺旋结构域,结构域运动： 结构域本身都是紧密装配的，结构域之间通过松散的肽键形成牢固而又柔韧的连接，为域间较大幅度的相对运动提供了可能，这种结构调整与其整体功能的行使密切相关。, /结构域,丙酮酸激酶结构域4,木瓜蛋白酶结构域1,无规则卷曲+ -螺旋结构域,无规则卷曲+-回折结构域,乳酸脱氢酶结构域1,+结构域,3-P-甘油醛脱氢酶结构域2,木瓜