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1、现代分析技术,第十章,第十章 高效液相色谱法及超临界流体色谱法,10.1 概述 10.2 高效液相色谱法的基本原理 10.3 高效液相色谱法的类型 10.4 高效液相色谱仪 10.5 超临界流体色谱法 10.6 实验技术,2,10.1 概述,HPLC high velocity, high resolution and high sensitivity High-Performance Liquid Chromatography High-Pressure Liquid Chromatography High-Price Liquid Chromatography,3,4,5,10.2 HPL
2、C的基本原理,GC的基本理论、基本概念适用于HPLC。液相色谱的van Deemter方程,6,板高H越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面 综合考虑，,提高HPLC的柱效的措施,采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀； 采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度； 流动相采用小分子溶剂，减小粘度( H2O、ACN、MeOH) ； 适当提高柱温，增大Dm； 采用一定的流动相流速u(一般1 mL/min),7,柱外效应：柱前峰展宽柱后峰展宽 柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起 柱前后展宽检测器流通池和连接管引起,10.3 HPLC的类型 I 液液分配色谱法 Liquid Liquid
3、 Partition Chromatography, LLPC,固定相与流动相均为液体(互不相溶)； 基本原理：组分在固定相和流动相上的不同分配而实现分离； 固定相：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；化学键合固定相：将 各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。,8,（1）寿命长，固定液不易流失，柱稳定性高； （2）传质快，表面均一，无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （4）选择性好，可键合不同基团改变其选择性； （5）耐受各种溶剂，有利于梯度洗脱；,流动相类别,流动相按极性分： 极性(乙腈、甲醇、水)； 弱极性(氯仿、乙酸乙酯)； 非极性(己烷)；,9,正相色谱法 反向
4、色谱法,采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,II 液固吸附色谱法 Liquid Solid Absorption Chromatography, LSAC,10,固定相：固体吸附剂（硅胶） 基本原理：根据组分在固定相上的吸附作用的不同进行分离； 样品分子(X)被流动相带入柱内，与流动相分子(S)在吸附剂的表面发生竞争性的吸附作用.,吸附平衡常数 K 越大，保留值越大。 LASC中，流动相：烷烃为底剂的二元或多元溶剂， 己烷乙酸乙酯；己烷氯仿,III 离子交换色谱法 Ion Exchange Chromatography, IEC,K
5、 越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强； 分析对象：离子(各种无机阴阳离子)：SO42+、NO3、Cl、Na、Mg等 有机酸碱、氨基酸,11,固定相：离子交换树脂 (聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物，硅胶键合离子交换剂) 流动相：含有反离子的水溶液 (柠檬酸根离子、CO3、F) 基本原理：样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离；,12,13,IV 离子对色谱法 Ion Pair Chromatography, IPC,固定相：C18/C8上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反 的离子对试剂 流动相：有机溶剂 (甲醇/乙腈水)加入离子对试剂 离子对试剂： 烷基铵类：(C
6、4H9)4N+OH- 、C16H33(CH3)3 N+OH- (分析X) 烷基磺酸类 ：己烷磺酸钠C6H13SO3Na (分析X) 基本原理：根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。,14,生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。 分析对象：有机酸、有机碱等,Column： IonPac NS1、NG1 Eluent ： 2 mM TBAOH, 24%48% ACN in 10 min Flow rate： 1.0 mL/min Detection： Conductivity (suppressor type) Regenerator：10 mN H2SO4 1. Meth
7、anesulfonic acid 5.0 g/mL (ppm) 2. 1-Propanesulfonic acid 8.6 3. 1-Butanesulfonic acid 8.7 4. 1-Hexanesulfonic acid 8.8 5. 1-Heptanesulfonic acid 8.9 6. 1-Octanesulfonic acid 8.9 7. 1-Decanesulfonic acid 9.1,0,Retention time (min),12,16,8,S,0.0,4,8.0,反相离子对色谱分离有机酸,V 离子色谱法 Ion Chromatography, IC,固定相：离
8、子交换树脂 流动相：电解质溶液（高电导） 分离原理：同IEC，离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测 特点：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变 成低电导成分降低背景干扰。,16,分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等,抑制器的作用,废液,17,抑制器,安装在电导池之前 提高待测离子的电导率： Na+, Cl- H+, Cl- 提高灵敏度 降低背景电导 (淋洗液) : Na+, HCO3- H2CO3 减少噪音,Na+, OH- H2O,18,抑制器的工作原理 (阴离子),X-: 样品中的阴离子 Y+: 样品中的阳离子,H2O,H2O,OH-,H2O Na+ Y+
9、X- Na+ CO32- (样品, 淋洗液),电极 （）,电极 （）,纯水或来自检 测器的流体,阳离子交换膜,阳离子交换膜,19,H2O,H2O,废液 / 气体,废液,H2O SO42- Y+ X- H+ MSA- (样品e, 淋洗液）,H+,抑制器的工作原理 (阳离子),X-: 样品中的阴离子 Y+: 样品中的阳离子,电极 （）,电极 （）,阴离子交换膜,阴离子交换膜,纯水或来自检测器的液体,20,20,VI 空间排阻色谱法 Size Exclusion Chromatography, SEC,22,动画,特点： 体积大的分子完全被排阻洗脱下来 体积小的分子最后的被洗脱下来 分析对象： 高聚
10、物，生物大分子（蛋白、核酸）,VII 亲和色谱法 Affinity Chromatography, AC,固定相：固定相表面键合特异性配基 流动相：类似LLPC（乙腈/甲醇、水等） 分离原理：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离 分离过程：一般流动相携带试样 亲和物与配基结合 强洗脱能力的流动相 洗脱亲和物（大分子）,23,分离对象： 酶与基质（或抑制剂） 抗原与抗体 激素与受体 外源凝集素与核酸的碱基对,10.4 高效液相色谱仪,24,仪器特点：高压、高效、高速 分离对象：生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物,工作过程：,高压输液系统,核心部件：高压泵 压力范围：30 5
11、0 KPa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10 m），液体的流动相高 速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的显著特点。,25,要求：1） 输液精度高,调节范围宽 分析型 0.1-10 mLmin-1 制备型 50-100 mLmin-1 2）流量稳定（保持柱效和分析重现性） 3）压力平稳、脉冲小（低背景噪音） 4）耐酸碱腐蚀等特性，泵的死体积小,26,单柱活塞往复泵,双柱活塞往复泵,进样系统 要求重复性好、死体积小。,普通进样装置：HPLC常用10 L注射器六通阀： 自动进样器： 清洗、取样、进样、换样等过程自动完成，一次可放 置数十个试样。,27,色谱柱,色谱柱
12、：实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱 性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。 预柱(保护柱)： 防止流动相或样品中的不溶性颗粒堵塞色谱柱 色谱填料： 经过制备处理后直径为5-10 m粒径的球形颗粒。 色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的HPLC分析柱尺寸是内径4.6 mm，长度有150 mm和250 mm。,28,色谱填料,29,色谱填料： 由基质和功能层两部分构成。 基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。（硅胶和有机高分子聚合物微球） 功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样
13、品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。 十八烷基硅烷（ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷（C8柱）、氨基或氰基等,HPLC检测器,a. 紫外检测器 Ultraviolet detector,30,DAD 1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，得到三维立体谱图,DAD可以得到三维的 色谱光谱图像,31,荧光检测器 Fluorescence detector,灵敏度高，选择性好，灵敏度比UV高101000倍； 要点：具有荧光或能形成荧光配合物 分析对象：氨基酸、维生素、 蛋白质等能发荧光的物质。,32,电化学检测 (电导检测、安培检测),原理：两个对电极测量样品中离子 型溶质的电
14、导，由电导的变化测定 溶质的浓度。 要点：死体积小，灵敏度高，pH7不够 灵敏。,33,原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流通过，电流大小与待测物质浓度成正比。 要点： 具有电活性物质,示差折光检测器 differential refractive index detector,原理：样品组分的折射率与流动相折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。 要点：灵敏度低，不能用于梯度洗脱,34,蒸发光散射检测器 evaporative light-scattering detector, ELSD,35,流出液雾
15、化器雾化加热漂移管加热溶剂蒸发激光束照在溶质颗粒产生光散射 散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关。,要点：通用型质量检测器， 可用于梯度洗脱 分析对象：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测,10.5 超临界流体色谱 supercritical fluid chromatography, SFC,36,定义： 以超临界流体为流动相的色谱分析法，具有GC和HPLC的优点，适于分析GC不能分析的高沸点、低挥发性的试样。 超临界流体： 在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。,超临界流体既不是气体，也不是液体，而是一种介于二者之间的一种对分离很有利的流体。,超临界
16、流体的特性,37,1）性质介于液体和气体之间； 气体的低黏度，传质阻力小，可以快速高效的分离； 液体的高密度，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质； SFC的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过改变SFC的密度调节组分分离， 超临界流体的密度与压力有关。,传质阻力小,适于低温,SFC的固定相和流动相,38,SFC色谱柱：填充柱 ：颗粒dp: 310 m, Lcol: 25 cm,固定液膜厚： 几mm 交联毛细管柱：颗粒 df: 0.05 1 m , Lcol: 10 20 cm,固定液膜厚0.05 1 m SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物,要点：CO2应用
17、最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解 性好，在紫外光区无吸收； 缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；,SFC的流动相：,超临界流体色谱仪器,39,与HPLC差别： HPLC只在柱入口加压，而SFC整个都处于高压下，使流动相处于高密度状态； SFC必须装有毛细管限流器，以实现限流器两端相的转变,高压泵 无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算 机控制流动相的密度和流量； 检测器 可采用HPLC的检测器(UV, FL)，也可采用GC的FID检测器.,SFC中的压力控制,40,压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效
18、率，淋洗时间缩短。 CO2流动相，当压力改变： 7.0 9.0106 Pa，则： C16H34的保留时间： 25 5 min。,程序升压,SFC的应用 I,聚苯醚低聚物的SFC分析 色谱柱：毛细管柱 (10 cm 63 m i.d.) 固定相：键合二甲基聚硅氧烷； 流动相：CO2 ； 柱温：120 C； 程序升压；,SFC既可分析GC中不适用的高沸点、低挥发性样品和HPLC中缺少检测功能团的样品，它又比HPLC有更高的柱效和更快的分析速度。 分析对象：天然产物、高聚物、表面活性剂等。,SFC的发展现状,43,SFC的三次起落： 1960s的先驱性研究； 1980s初形成浪潮，认为会掀起分析方法
19、的革命； 目前，大公司纷纷撤去SFC分离设备，放弃进一步发展的计划。,缺点： a. 整个体系都要在高压下进行； b. 流动相的选择有限 (CO2)； c. 仪器制造复杂，昂贵；,G.Guiochon (American Lab 1998, (9), 1415)指出成功和普及并成为定量分析方法必须具备： 易于使用，操作费用低， 能够得到准确，可重复的定量结果， 要能够解决至少一个分析化学中的重要问题. 如，1960s的GC用于石油和石化产品分析；1970s的HPLC用于药物、代谢物和生物化学品的分析。,超临界流体萃取 Supercritical Fluid Extraction, SFE,44,
20、超临界萃取：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差 别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。 超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度大为提高。 常用的超临界流体在常压下多为气体，易同萃取溶质完全分离，使样品得到充分的浓缩而不干扰下一步的分析，,超临界萃取的特点,45,基本解决了溶剂对环境的污染 萃取时间短: 15 45 min 萃取更彻底 可进行热敏样品及痕量样品萃取 节省萃取费用,CO2有毒吗？,10.6 实验技术,46,b. 衍生化技术：柱前衍生 柱后衍生 紫外衍生反应（苯甲酰化反应、二硝基氟代苯反应、苯基异硫氰酸酯反应） 荧光衍生化试剂（丹磺酸酰氯、丹磺酸酰阱、荧光胺、OPA等）,a. 分离方式的选择,c. 梯度洗脱,47,HPLC中的梯度洗脱相当于GC中的程序升温。 梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的组成和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离,固定相：C18 流动相：20%甲醇-水100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 检测器：紫外检测器,发展趋势 （LC/MS/FRIR/NMR LC/LC/GC）,第十章 习题,Page 246 Q. 9，Q.10,49,