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1、分子生物学实验,实验十二 原核蛋白质SDS-PAGE电泳技术,1.实验目的： 利用SDS-PAGE电泳检测表达蛋白，确定蛋白质的分子量。并掌握其原理与方法。 2.实验原理： 天然蛋白质在电场中泳动的迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量的大小以及分子形状等因素。1967年Shapiro等人发现，在有阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate -SDS)存在时，蛋白质的迁移率主要取决于它的分子量大小，而与其所带电荷的多少以及形态无关。,SDS能够打开蛋白质的氢键和疏水键，使蛋白质变性为松散的线状。同时大多数蛋白质能够按每个氨基酸与固定量的SDS结合，形成蛋白质SDS
2、复合物。其结果：1、SDS带有很强的负电荷，所以使SDS复合物都带有相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质分子原有的电荷差别；2、SDS与蛋白质结合后改变了蛋白质原有的构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似长椭圆柱形。不同蛋白质SDS复合物的短轴直径都一样，约为18A，而长轴则与蛋白质分子的大小呈正比。这样SDS蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不受蛋白质原有电荷及形状的影响，而取决于椭圆柱的长度，即蛋白质分子量的大小。,不同浓度的聚丙烯酰胺适用于不同范围的蛋白质分子量大小的测定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持剂的一种电泳
3、方法。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺简称Acr(Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺简称Bis在催化剂作用下聚合而成。TEMED称为四甲基乙二胺作为催化剂，AP过硫酸铵作为活化剂。AP活化TEMED，活化的TEMED催化丙烯酰胺结合成长链，并由甲叉双丙烯酰胺的横链连接起来，形成立体的网状结构，因此甲叉双丙烯酰胺是一种引入横链的交联剂。这样一定比例的丙烯酰胺(简称Acr)和甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在AP和TEMED催化下就能够形成一种具有多孔、多分枝而又相互连接的聚丙烯酰胺凝胶。,聚丙烯酰胺胶液灌入玻璃管中，凝固后垂直电泳称为管状电泳，灌入两块玻璃板之间的狭缝中，凝固后垂直电泳称为板状电泳。聚丙烯
4、酰胺凝胶电泳系统，可以仅有一种浓度的凝胶，一种pH值和一种缓冲液组成，称为连续系统；也可以有两种以上不同浓度的凝胶、pH值及缓冲液组成，称为不连续系统。,3.材料与仪器 诱导的细菌裂解液，制胶夹，电极架，移液器 4.试剂与配制 配制储存液：（1）30%凝胶贮液（W/V）： 29.2g Acr（丙烯酰胺）；0.8g Bis（甲叉双丙 烯 酰胺） 用D.D.W.溶解，定容至100毫升。过滤，4C，棕色瓶避光保存有效期为30天。 （2）10%SDS: 10gSDS溶于100mlD.D.W.,过滤，室温备用。 （3）电极缓冲液（pH8.3）：3.0g Tris(三羟甲基氨基甲烷)；14.4g 甘氨酸；
5、1g SDS， 用D.D.W.溶解后定容至1000毫升。室温贮存。 （4）1.5MTris-HCl 缓冲液(pH8.8)：36.342g Tris；120.ml D.D.W 溶解后用浓HCl粗调pH,而后用1NHCl精调pH至8.8,定容至200毫升。4C贮存。 （5）0.5MTris-HCl缓冲液（pH6.8）: 12.114g Tris；150ml D.D.W. 溶解后用浓HCl（12N）粗调pH，用1NHCl精调pH，定容至200ml。4C贮存。 （6）10%AP：1g AP溶于9mlD.D.W.,现配为好。 （7）TEMED：冰箱保存。 （8）样品缓冲液：1.0ml 0.5MTris-
6、HCl (pH6.8)；0.8ml 甘油；1.6ml 10%SDS； 0.4ml 2-巯基乙醇；4.0mlD.D.W. ；混匀后，4C备用。 （9）无水乙醇 （10）脱色剂：500ml 无水乙醇；160ml 醋酸，定容至2000ml，室温备用. （11）染色液： 300ml 脱色液；0.6g考马斯亮兰R250；溶解，过滤，棕色瓶室温贮存。,目前常采用的不连续系统的主要特点在于1. 使用两种不同浓度的凝胶系统；2.两种凝胶基质中与电泳槽中使用的缓冲溶液成分和pH值是不相同的。板状电泳中，电泳凝胶分为两层；上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，此胶的缓冲液是Tris-HCI,pH6.8;下层
7、胶则为高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，此胶的缓冲液是Tris-HCI,pH8.8;电极缓冲液则是Tris-HCI,甘氨酸,pH8.3。 非连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中存在有三种物理效应：（1）样品的浓缩效应，（2）分子筛效应，（3）电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。,5. 操作步骤: （1）用无水乙醇把电泳槽、玻璃板等一系列用品擦洗干净。 （2）安装好制胶装置。,样品制备： （1）诱导后，取500ul菌液，8000 rpm，2min。 （2）弃上清，用800ul PBS 重悬，8000 rpm,2 min。弃上清。同样步骤再洗一次。 （3）然后加15ul的PBS和
8、15ul的上样buffer。 （4）沸水浴煮沸10min，12000 rpm,离心10 min。 （5）取上清液10ul进行电泳。 注：（1）非诱导的菌液作为阴性对照。 （2）电泳时，稳流25mA。,(5) 加样：上层胶凝后，拆掉制胶装置，取下蓝色胶条，再安装好制胶装置。添加电极缓冲液，不漏时置于电极架上，小心取出样品梳；可加样。用微量进样器加样，注意添加Marker。 （6）电泳：加样完毕，往槽中加电极缓冲液，淹没电极架下缘。盖好槽盖，插好电极，冰浴中开始电泳。 （7）染色：电泳毕，小心将剥下的胶片置于培养皿内，倒入染色液，约染40分钟。 （8）脱色：将染色液倒入回收瓶中，于培养皿内注入脱色液，1-2小时更换1次新液，直至底色脱净为止。注意回收脱色液（活性炭吸附后可重复使用）。 （9）照相及扫描。,5l,