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1、1. 欲从一种真菌中分离苹果酸脱氢酶，现将培养好的菌体加入缓冲液，通过超声波法破碎细胞，过滤得到含酶的抽提液。假设已建立该酶活力测定的方法，请设计一个硫酸铵分级沉淀获得该酶的方法，写出具体步骤，并计算分级沉淀时硫酸铵的加入量。,1) 20%饱和度硫酸铵沉淀 取100 ml 酶抽提液置冰浴。根据硫酸铵饱和度表，查出应称取固体硫酸铵10.6g，每次缓慢加入少许硫酸铵，边加边搅拌，同时检测溶液pH值，如果pH呈酸性可加少量NaOH维持酶抽提液的pH值。置冰箱4 h，离心，沉淀置冰箱用于测酶活力，上清液测量体积。,2) 30%饱和度硫酸铵沉淀 假如上清液体积为98 ml，根据表计算称取固体硫酸铵为5.
2、39g，其他操作同上。,3) 40%-80%饱和度硫酸铵沉淀 根据上清液体积计算称取固体硫酸铵量见下表,4) 将不同饱和度获得的硫酸铵沉淀用少量缓冲液溶解，测酶活力。以不同饱和度硫酸铵为横坐标，酶活力为纵坐标作图，见下图。,10,20,30,40,50,（酶活力单位 U/ml）,5) 根据上图向酶抽提液加40%饱和度硫酸铵，置冰箱过夜，离心，弃沉淀。上清液测量体积，继续加硫酸铵使其饱和度达到70%，置冰箱过夜，离心，收集沉淀。,2. 请根据下述稳态法推导的有序机制方程，自行设计虚拟数据，用作图法求出动力学常数Vm、Kia、KmB和KmA，写清楚每一步骤。,固定底物B浓度，改变A的浓度，上式同除以B可得：,把上式变成倒数方程：,以1/对1/A作图，斜率为:,纵轴截距为：,横轴截距为：,在不同固定B的浓度下以1/A对1/进行一次作图。,以一次作图中的1/B对纵轴截距作图：,纵轴截距 =,斜率为：KmB/Vm 纵轴截距为：1/Vm,1/Vm =0.82 Vm =1.22 1.14 =KmB/Vm KmB =1.39,1,2,4,0.5,1,1.5,2,2.5,3,以一次作图中的1/B对斜率作图：,斜率 =,斜率为：KiaKmB/Vm 纵轴截距为：KmA/Vm,KmA/Vm =0.07 KmA=0.085 1.27=KiaKmB/Vm Kia =1.14,3,