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1、第七章,真核细胞内膜系统 蛋白质分选与膜泡运输,第一节,细胞质基质 的涵义与功能,1.1 细胞质基质的涵义,基本概念 细胞质基质是细胞质内除细胞器和内含物以外的、较为均质和半透明的胶状物质。生物化学家称之为胞质溶胶。 成分极其庞杂 中间代谢有关的酶类、细胞骨架结构、大量的蛋白质和RNA分子 。 特点高度有序的体系 多酶复合体 锚定于细胞骨架上 附着于生物膜上,细胞质基质是细胞的重要的结构成分， 其体积约占细胞质的一半,肝细胞中细胞质基质及细胞其它组分的数目及所占的体积比（引自Albert.1998）,1.2 细胞质基质的功能,中间代谢和生物合成；信号传递 与细胞质骨架相关的功能 维持细胞形态、
2、运动、胞内物质运输及能量传递等 蛋白质的修饰和选择性的降解 蛋白质的修饰 控制蛋白质的寿命 降解变性和错误折叠的蛋白质 帮助变性或错误折叠的蛋白质重新折叠,蛋白质正确的折叠由许多蛋白因子的帮助,没有信号序列的蛋白质将留在细胞质基质,细胞质基质与胞质溶胶,早期学者把差速离心去除各种细胞组分后最终留下的富含蛋白质的组分称为“胞质溶胶” 胞质溶胶中的成分与细胞质基质周围的溶液成分有很大不同 细胞质基质与细胞骨架的关系 细胞骨架为细胞质基质中其它成分和细胞器提供锚定位点 细胞骨架成分装配和解聚与周围液相的动态平衡,第二节,细胞内膜系统 及其功能,细胞内膜系统（endomembrane system）,
3、内膜系统的定义 在结构、功能和发生上相关的，由膜围绕的细胞器或细胞结构 内膜系统的组成,内膜系统： 真核细胞内在结构、功能及发生上相关的膜相结构的总称,内质网,核膜,溶酶体,高尔基体,分泌泡,内膜系统的意义 扩大了细胞内的膜面积 高度分区化 膜分化 内膜系统的特点 动态结构，具有流动性、镶嵌性、不对称性和蛋白质的极性,细胞内膜系统的研究方法, 放射自显影（Autoradiography） 生化分析（Biochemical analysis） 遗传突变分析（Genetic mutants）,2.1 内质网(endoplasmic reticulum,ER),内膜系统的发源地 真核细胞大分子合成基
4、地,2.1.1 内质网的形态结构,由封闭的膜系统及其围成的腔形成的互相沟通的网状结构 使细胞内膜的表面积大增 形成了完整封闭体系 是细胞内除核酸外的大分子合成基地,内质网的类型,糙面内质网（ rough endoplasmic reticulum，rER） 扁囊状，排列整齐，膜表面分布着大量的核糖体 光面内质网（smooth endoplasmic reticulum，sER） 分支管状，只是内质网连续结构的一部分 微粒体（microsome）,rER 是ER与核糖体 组成的功能性复合体,内质网腔,内质网膜,Microsome (100-200nm),糙面微粒体,光面微粒体,微粒体（micro
5、some） 在细胞匀浆和超速离心过程中，由破碎的 内质网形成的近似球形的囊泡结构,2.1.2 内质网的功能 ER是细胞内蛋白质与脂类合成的基地,蛋白质的合成 分泌的蛋白质 膜的整合蛋白 可溶性驻留蛋白 脂质的合成,蛋白质的修饰与加工 新生多肽的折叠与装配 rER的功能,分泌蛋白在内质网上合成过程,在游离核糖体上起始多肽链的合成，至80个氨基酸残基 信号识别颗粒与信号肽结合合成暂停 信号识别颗粒与DP结合；核糖体与内质网膜上的易位子（translocon）结合 信号识别颗粒脱离，返回胞质，重新利用 肽链穿入内质网腔，合成继续 信号肽被腔面上的信号肽酶切除，肽链继续延伸直至完成整个多肽链的合成,N
6、-linked: linked to the amide nitrogen of asparagine ( in ER ) O-linked: linked to the hydroxyl group serine or threonine via GalNac ( in Golgi ),蛋白质的修饰与加工N连接的糖基化,N连接糖基化发生于内质网，在高尔基体中继续进行加工,sER的功能,类固醇激素的合成 肝细胞中：合成外输性脂蛋白颗粒的基地 肝细胞葡萄糖的释放（G-6PG） Ca2浓度的调控,膜脂的合成,包括磷脂和胆固醇在内的几乎全部膜脂的合成 磷脂合成酶是ER膜整合蛋白，活性位点朝向细胞质基
7、质 转位与转运,非还原性的内腔，易于二硫键形成 蛋白二硫键异构酶 驻留蛋白具有KDEL或 HDEL信号 结合蛋白 （Binding protein，Bip）,新生多肽的折叠与装配,2.1.3 内质网与基因表达的调控,影响内质网细胞核信号转导的三种因素： 内质网腔内未折叠蛋白的超量积累 折叠好的膜蛋白的超量积累 内质网膜上膜脂成份的变化主要是固醇缺乏 不同的信号转导途径诱导不同的基因活化，最终调节细胞核内特异基因表达,2.2 高尔基体 ( Golgi Complex ),形态 扁平膜囊和大小不等的囊泡 极性 位置、方向、物质转运与生化极性 组成 高尔基体顺面网状结构（CGN） 高尔基体中间膜囊（
8、medial Golgi） 高尔基体反面网状结构（TGN） 周围大小不等的囊泡 （高尔基小泡、分泌泡） 结构特点 动态结构,高尔基体的形态结构,顺面,反面,CGN,TGN,中间膜囊,高尔基 小泡,分泌 小泡,a)嗜锇反应区 CGN b) 甘露糖苷酶 中间膜囊 c) CMP酶特异性反应 TGN,高尔基体各部膜囊的标志细胞化学反应,高尔基体的动态结构,2.2.2 高尔基体的功能,高尔基体与细胞的分泌活动 蛋白质的糖基化及其修饰 蛋白酶的水解和其它加工过程 蛋白质的分选及运输,高尔基体与细胞的分泌活动,转运途径：分泌性蛋白、膜蛋白、溶酶体酶、胶原纤维等胞外基质等成分都是通过高尔基体完成其定向转运过程
9、的。 蛋白质的分类与转运：蛋白质的分选及其转运的信息仅存在于编码该蛋白质的基因本身，如分选信号序列 溶酶体酶的分选：M6P，反面膜囊M6P受体,细胞的分泌活动,A model for the retrieval of ER resident proteins. The KDEL receptor captures the soluble ER resident proteins and carries them in COPI-coated transport vesicles back to the ER. Neutral pH: dissociate from the KDEL; low
10、pH: binding the KDEL,蛋白质的糖基化及其修饰,类型 N-连接糖基化 O-连接糖基化 特点 没有模板 分区定位 复杂的加工 意义 分选信号 蛋白质的构象和稳定性 蛋白质的水溶性及蛋白质所带电荷的性质,蛋白酶的水解和其它加工过程,方式 蛋白原在高尔基体内切除N-端或两端的序列 蛋白质前体在高尔基体中水解生成有活性的多肽 不同信号序列使同一种蛋白质前体在不同细胞、以不同的方式加工产生不同的多肽 意义 确保小肽分子的有效合成 弥补缺少包装并转运到分泌泡中的必要信号 有效地防止这些活性物质在合成它的细胞内起作用,物质的分选与运输 高尔基体的功能,2.3 溶酶体的结构和功能,溶酶体（l
11、ysosome）是单层膜围绕、内含多种酸性水解酶的囊泡状细胞器。其主要功能是进行细胞内的消化作用,2.3.1 溶酶体形态结构与类型,溶酶体酶： 60余种，异质性（ heterogenous） 最适pH为5.0左右 标志酶酸性磷酸酶（acid phosphatase）,Histochemical visualization of lysosomes. Electron micro-graphs of two sections of a cell stained to reveal the location of acid phosphatase, a marker enzyme for lyso
12、somes. The larger membrane-bounded organelles, containing dense precipitates of lead phosphate, are lysosomes, whose diverse morphology reflects variations in the amount and nature of the material they are digesting. The precipitates are produced when tissue fixed with glutaraldehyde is incubated wi
13、th a phosphatase substrate in the presence of lead ions. Two small vesicles thought to be carrying acid hydrolases from the Golgi apparatus are indicated by red arrows in the top panel. (Courtesy of Daniel S. Friend.),溶酶体的组织化学,溶酶体的结构类型,初级溶酶体（primary lysosome） 次级溶酶体（secondary lysosome） 自噬溶酶体（autophag
14、olysosome） 异噬溶酶体（phagolysosome） 残余小体（residual body）,是否存在作用底物,底物来源不同,Primary Lys.,Second Lys,Residual body,溶酶体的类型,初级溶酶体 次级溶酶体 自噬溶酶体 异噬溶酶体 残余体,溶酶体膜的特性,膜内侧高度糖基化 膜结构完整 膜上H泵 pH5.2 膜上载体蛋白 向胞质输送养料,A,2.3.2 溶酶体的功能,溶酶体的功能 基本功能消化作用,细胞的自我更新（自噬作用） 防御功能 作为细胞内的消化“器官”为细胞提供营养 其它特殊功能：细胞分泌 顶体反应 细胞凋亡（自溶作用) 免疫功能 ,自噬作用：
15、溶酶体与自噬泡融合，将自 身的某些结构加以降解。,自溶作用： 溶酶体膜受损，其内酸性 水解酶大量释放到细胞质 空间，造成细胞溶解死亡。,溶 酶 体 与 疾 病,贮积症：溶酶体酶缺失或异常，导致某些物质不被消化，而遗留在溶酶体中，影响细胞代谢，引起疾病。 矽肺：二氧化矽引起的细胞自溶作用 类风湿关节炎：溶酶体膜的脆性致溶酶体酶泄漏,2.3.3 溶酶体的发生,关键：M6P 6磷酸甘露糖 M6P-R 6磷酸甘露糖受体,M6P作为溶酶体酶的标志,Targeting of soluble lysosomal enzymes to endosomes and lysosomes by M-6-P tag,
16、Phosphorylation of mannose residues on lysosomal enzymes catalyzed by two enzymes,phosphoglycosidase,溶酶体酶分选与局部浓缩（TGN）,M6P去磷酸化（前溶酶体）,溶酶体的发生,分选信号M6P,溶酶体酶的合成及N-连接的糖基化修饰（RER）,寡糖链上的甘露糖残基磷酸化（CGN）,受 体 再 循 环,UDPGlcNAc UMP,N-乙酰葡萄糖胺磷酸转移酶,磷酸葡萄糖苷酶,GlcNAc,溶酶体酶的合成及N-连接的糖基化修饰（RER）,高尔基体cis膜囊寡糖链上的甘露糖残基磷酸化,M6P,N-乙酰葡萄
17、糖胺磷酸转移酶,高尔基体trans-膜囊和TGN膜（M6P受体）,溶酶体酶分选与局部浓缩,以出芽的方式转运到前溶酶体,磷酸葡萄糖苷酶,磷酸化识别信号：信号斑,溶酶体发生途径,溶酶体的发生,2.3.4 溶酶体与过氧化物酶体 过氧化物酶体(peroxisom)又称微体(microbody),形态结构 囊泡结构单层膜围绕，0.5um，圆形、椭圆形或哑呤形 内含物过氧化氢酶（标志酶） 依赖黄素（FAD）的氧化酶 特点 异质性的细胞器 尿酸氧化酶结晶,过氧化物酶体的功能 RH2+O2R+H2O2 H2O2 +RH2R+ H2O,动物细胞（肝细胞或肾细胞）解毒作用 分解脂肪酸等高能分子向细胞直接提供热能
18、植物中叶肉细胞，光呼吸反应 种子萌发，乙醛酸循环,过氧化物酶体的发生,分裂方式增值，进一步装配成熟 膜脂可能在内质网上合成后转运而来 蛋白成分在细胞质基质中合成，然后转运到过氧化物酶体,第三节 细胞内蛋白质的分选与膜泡运输,3.1 信号假说与蛋白质分选信号,信号假说(Signal hypothesis) 信号肽（Signal peptide）与共转移 导肽（Leader peptide）与后转移,3.1.1 信 号 假 说,信号假说内容 分泌蛋白N端序列作为信号肽，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，在蛋白质合成结束之前信号肽被切除。 指导因子 蛋白质N-端的信号肽（signal peptide）
19、 信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP） 信号识别颗粒的受体（停泊蛋白docking protein，DP）等,3.1.2 信号肽与共转移,信号肽与信号斑： 分泌蛋白开始合成时N端的一段1626个氨基酸残基序列 ，以此指导分泌蛋白在糙面内质网中的合成和转运，在蛋白质合成结束前被切除 共转移（Cotranslocation） 肽链一边合成一边转移到内质网腔中的方式 起始转移序列和终止转移序列 起始转移序列和终止转移序列的数目决定多肽跨膜次数 只有N端信号序列的肽链将进入内质网腔,信号肽与信号斑,信号肽的作用,信号肽作用机制,信号肽 信号肽识别颗粒（SRP）
20、,SRP受体 易位子,关键开始转移序列 停止转移序列,进入内质网腔,跨膜蛋白,开始转移序列 即信号肽序列 停止转移序列 肽链中某些序列 与内质网膜的亲和力 很强，这段序列不再 转入内质网腔中,关键开始转移序列 停止转移序列,多次跨膜蛋白,3.1.3 导肽与后转移,导肽 指导线粒体、叶绿体中的绝大多数蛋白质和过氧化物酶体中的蛋白质从胞质中转移到相应细胞器的信号序列 后转移（post translocation） 蛋白质在细胞质基质中合成以后再转移到这些细胞器中 蛋白质跨膜转移过程需要ATP使多肽去折叠，还需要一些蛋白质的帮助（如热休克蛋白Hsp70）使其能够正确地折叠成有功能的蛋白。,3.2 蛋
21、白质分选的基本途径与类型,合成两条基本途径 细胞质基质中完成合成 主要在糙面内质网上合成 转运四种基本类型 蛋白质的跨膜转运 膜泡运输 选择性的门控转运 细胞质基质中的蛋白质的转运,细胞内 蛋白质的分选,游离核糖体 附着核糖体,线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞质基质,内质网、高尔基体、溶酶体、膜蛋白、分泌蛋白,蛋白质分选途径,3.2 膜泡运输,膜泡运输是蛋白运输的一种特有的方式，普遍存在于真核细胞中。在转运过程中不仅涉及蛋白本身的修饰、加工和组装，还涉及到多种不同膜泡定向运输及其复杂的调控过程。 三种类型的包被小泡 网格蛋白包被小泡 COPII包被小泡 COPI包被小泡 膜泡运输是特异性过程
22、，涉及多种蛋白识别、组装、去组装的复杂调控。,膜泡运输,3.3.1 网格蛋白包被小泡,相关运输途径 高尔基体TGN质膜、胞内体或溶酶体和植物液泡 受体介导的细胞内吞途径 胞内体溶酶体 结构 网格蛋白 衔接蛋白 高尔基体TGN是网格蛋白包被小泡形成的发源地,Clathrin coated vesicles,Selective transport by clathrin coated vesicles,3.3.2 COPII 包被小泡,相关运输途径 内质网高尔基体的物质运输 结构 COPII包被由5种蛋白亚基组成 包被蛋白复合物的装配与去装配依赖于Sar蛋白 选择性浓缩 大多数跨膜蛋白是直接结合在
23、COP II衣被上，少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COP II衣被结合。 分选信号位于跨膜蛋白胞质面的结构域，形式多样，有些包含双酸性基序DEXDE ，如Asp-X-Glu序列,COPII-coated vesicles move materials from the ER to the Golgi.,The assembly of a COPII-coated vesicles. SarGTP binding protein: Sar-GTP binds to the ER; Sar-GDP dissociates from the ER,Antibodies is able to
24、block the budding of vesicle from ER but have no effect on vesicle transport from one Golgi compartment to another in mammalian cell.,3.3.3 COPI 包被小泡,相关运输途径 GolgiER逆行转运（回收、转运内质网逃逸蛋白返回内质网） 非选择性的批量运输（ bulk flow ） 顺行转运从ERER-Golgi ICGolgi 结构 COPI包被含有8种蛋白亚基 包被蛋白复合物的装配与去装配依赖于ARF 细胞器中保留及回收蛋白质的两种机制 转运泡将应被保留
25、的驻留蛋白排斥在外，防止出芽转运 通过识别驻留蛋白C-端的回收信号的特异性受体，以COPI-包被小泡的形式捕获逃逸蛋白,Cop I Vesicles,内质网蛋白驻留信号 Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）,A model for the retrieval of ER resident proteins. The KDEL receptor captures the soluble ER resident proteins and carries them in COPI-coated transport vesicles back to the ER. Neutral pH: dis
26、sociate from the KDEL; low pH: binding the KDEL,Cop I and II Vesicles,膜泡融合是特异性的选择性融合,选择性融合的基础 供体膜蛋白与受体膜蛋白的特异性相互作用 糙面内质网相当于重要的物质供应站 高尔基体起枢纽作用 每种结构具有各自特异的成分，这是行使复杂的膜泡运输功能的物质基础，但是在膜泡中又必须保证各细胞器和细胞间隔本身成分特别是膜成分的相对恒定,3.4 细胞结构体系的组装,自我装配（self-assembly） 协助装配（aided-assembly） 直接装配（direct-assembly）,装配的生物学意义,减少和校正蛋白质合成中出现的错误 减少所需的遗传物质信息量 通过装配与去装配更容易调节与控制 多种生物学过程,分子“伴侣”（molecular chaperones）,细胞中的某些蛋白质分子可以识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽并与多肽的某些部位相结合，从而帮助这些多肽转运、折叠或装配，这一类分子本身并不参与最终产物的形成，因此称为分子“伴侣”。,蛋白质的共价修饰,磷酸化和去磷酸化 糖基化：N乙酰葡萄糖胺 N端甲基化 酰基化,