色谱基础理论-20140321.ppt

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1、色谱基础理论,林直宏 Email：L,目录,三,高效气相色谱仪的结构与原理,一、色谱法的基本理论,80%-85%的有机化合物,色谱法的起源,20世纪初，俄国科学家茨维（M.S.Tswett）提出经典液相色谱法后，色谱分析法取得了迅速的发展，,分离基本模型,3种组分同时进入色谱柱,3种组分开始在色谱柱中分离,3种组分在色谱柱中基本达到分离,3种组分在色谱柱中完全达到分离,色谱法，即利用组分在体系中固定相与流动相的分配差异，将混合物组分进行分离和测定的方法。,色谱分类,GC 进样方式：样品转化为液体 流动相：惰性气体，不予组分发生反应，黏度10-5Pas，输出压力0.11.0MPa。 固定相： 1

2、、分离机理：吸附、分配、络合、手性作用 2、色谱柱：填充（粒度0.1-0.5mm，柱内径1-4mm，柱长1-4m，柱效102-103；毛细（内径0.1-0.5mm，柱长10-100m，柱效103-104）；柱温室温-420。 检测器：FID、TCD、ECD、FPD、NPD 应用范围：低分子量、低沸点有机化合物；永久气体。,LC 进样方式：样品需为液体 流动相：离子型、极性、弱极性或非极性溶液，可与被分析组分发生反应，黏度10-3Pas，输出压力45MPa。 固定相： 1、分离机理：吸附、分配、筛析、离子交换、亲和、手性作用。 2、色谱柱：填充（粒度5-10um，柱内径3-6mm，柱长10-25

3、cm，柱效104；柱温室温-50。 检测器：UVD、DAD、FD（荧光）、ECD（电导）、RID、ELSD 应用范围：低分子量、部分低沸点、高沸点、高分子量有机化合物；离子型化合物；生物活性物质。,基本术语,色谱图,检测信号和时间的关系图 不同的色谱峰对应相应的组分 可以得到相应组分的保留时间和峰面积信息。 保留时间 定性分析 峰面积 定量分析,基本术语,保留时间（Retention time)： 组份从进样到出现最大值所需要的时间，tR 死时间(dead time): 不被固定相滞留的组份，从进样到出峰最大值所需要的时间，t0 峰高（Peak Heigh) 从峰最大值到峰底的距离, 峰面积（

4、Peak Area) 峰与峰底之间的面积,出峰异常-无峰或峰很小,GC A.色谱柱连接是否正确 B.系统是否有漏 C.检测器是否工作开启，如FID点火了吗？FID高压静电正常吗？ TCD加电流了吗 D.柱中是否有载气 E.样品是否降解、沉淀,LC A.色谱柱连接是否正确 B.系统是否有漏 C.检测器是否正常，如UVD的是否能力异常，R/S是否正常；氘灯是否点亮 D.流动相组分、纯度、配比是否正常 E.样品是否降解、沉淀,基线(base line),基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)基线信号的波动。

5、流动相波动、电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、色谱柱被污染所致。 漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。,基线异常-噪声、漂移变大或不规则,GC 流动相：载气不纯 气源输出不稳 气路有漏气 检测器被污染 色谱柱被污染,LC 流动相：流动相非色谱纯，使用试剂、水或药品不纯，或被污染；有气泡 泵输液不稳 检测器故障，如流过池漏液 色谱柱被污染,分离度（Resolution),当R=1 时，有5的重叠； 当R=1.5时，分离程度为99.7%，可视为基线分离 毛细管色谱柱比填充柱有更高的分辨

6、率。,两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示：,峰的形状,理想的峰型是高斯曲线. 分子的理论统计学分布,拖尾因子(tailing factor，T),用以衡量色谱峰的对称性。 也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。 中国药典规定T应为0.951.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。,峰型异常-前伸峰,GC 峰伸舌多为色谱柱过载，减小进样量，使用大容量柱子 提高OVEN，INJ温度； 进样技巧提高。 色谱柱的连接,LC 死体积太大 样品溶液的配比极性与流动相的极性相差太大。 减少进样量； 保护柱或

7、柱失效,峰型异常-峰拖尾,GC 溶剂/固定相极性不相匹配 色谱柱安装不正确 同时有两个峰流出 分流比太小,LC 色谱柱被污染或失效 进样阀漏液,峰型异常-峰开叉,GC 进样口污染 色谱柱被污染 样品被污染，混入难分离杂质 检测器被污染,LC 保护柱污染 柱失效 样品被污染，混入难分离杂质,分配系数(distribution coefficient，K),在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。,分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分,LC:流动相（组分比例、pH）、流速、进样量 GC:流速

8、、温度、进样量,峰展宽的度量. 以塔板数来表示 类似蒸馏中的气液平衡,柱效（Column Efficiency),例如，图示中塔板数为3.,塔板理论,理论塔板数为：,n=5.54(tR/W1/2)2,速率方程,气相色谱速率方程（ Van Deemter方程）,液相色谱速率方程（即Giddings方程）,A B C,A B C,van Deemter曲线,（颗粒度和柱床填装的优良程度）,Height Equivalent to Theoretical Plate,线速度 U （mm/sec）,HETP,最低HETP =最优化的塔板数,H,（传质）,（纵向扩散）,HETP PLATES,影响色谱柱

9、效率的因素,A. 涡流扩散 (不同路径的影响 ).,采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效 毛细管柱可忽略该项,A2dp，dp为填料直径，为填充不规则因子，填充越不均匀越大。,对于HPLC来说,颗粒度越小柱效越高 颗粒度控制着分离的质量 更小的颗粒度： 使最高柱效点向更高线速度方向移动 有更宽的线速度范围 降低颗粒度不但可以增加柱效，同时也增加分离速度,van Deemter 曲线的挑战,如果填料的颗粒继续演变,HPLC（高效液相色谱法）填料颗粒尺寸的演变,如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？,影响色谱柱效率的因素,B. 纵向扩散.,气相中分子的扩散 主要决定于气体流速,由于进样后溶质

10、分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。,B/u2Dm/u。 u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。 Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-410-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。 是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。一般在0.60.7左右，毛细管柱的1。,影响色谱柱效率的因素,C. 传质阻力.,对于GC来说 主要取决于气体的流速和固定相量的多少。,由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。,对于LC来说,流动相传质阻抗

11、,静态流动相传质阻抗,这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。,这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。,高柱温,颗粒越小，微孔孔径越大,固定相传质阻抗,只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。,速率方程给我们的启示,进样时间要短。 填料粒度要小。 改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。 适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最

12、小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.030.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。 较小的检测器死体积。,例：载气对Van Deemter图的影响, N2, 变化最大, 可得到最低的HETP. H2 和 He 曲线较平坦，即使较高的流速下也能得到较低的HETP，所以即使在较高的分析速度时，也可以得到较好的分离度.,常用毛细管柱的最佳载气流量,二、气相色谱仪的结构及检测器原理,作用： 1）载气：作为色谱的流动相 2）检测器的工作气体。,载气： -惰性：He, Ar, N2, H2. -根据检测器, 价格及方便程度来决定 -采用压力调节器

13、以获得恒定的仪器输入压力 -控制流量来得到恒定的流速,气源,气体进口及连接 （9790型）,进样口,作用：样品进样和汽化. 要求：精度和重现性 根据样品的性质选择进样技术,填充柱进样口,毛细管柱进样口,色谱柱,液膜：0.25-12m,检测器,热导检测器（TCD）,气相色谱最早的检测器, 1946. 测量样品气流导热性能的变化。 热导-热量从高温物体到低温物体的传导。,两个平行的气流，样品和参考。 惠斯通电桥用来比较两个气流的阻抗。 气流的速度、压力及电的变化影响被最小化。,氢火焰检测器（FID）,最常用的GC 检测器. - 是有机物的通用型检测器。 - 检出限 5pg. - 线性范围可达7个数

14、量级 . - 容易操作 破坏型检测器样品燃烧 信号值大小取决于碳原子数目及替代物的数量。,响应,离子数目正比于碳原子数目(C-H键). 一些官能团如羰基(CO=)、羟基(OH）、卤素（X）、胺（NH4+）则很少或根本不会离子化。 对无机气体如H2O, CO2, SO2, 和Nox不灵敏。 火焰 以氢气和空气作为燃气。 在控制的流速下进行电子点火。 火焰无色除非受到污染。,设计结构,FID电路设计（9790）,基流；可变电阻,补偿抵消,电子捕获检测器（ECD）,非破坏性。 对卤素、过氧化物、醌类金属有机物及硝基化合物非常灵敏，0.03pg。 而对胺类、醇类及碳氢化合物不灵敏。 线性窄， 103

15、.,主要用于食品、制药、环保等领域，检测痕量含卤素等的样品 一定不要试图去拆卸该检测器,ECD原理, 射线粒子使载气离子化: N2 + N2 + e- 在电场中生成的正离子和电子向两极移动形成基流。 当电负性样品进入后即捕获慢速低能量电子使基流下降形成信号。 e- + sample current loss,12, f=f-f0=k 其中： f：脉冲频率 f0：基本脉冲频率（只有载气通过ECD时的脉冲频率） k：由电子捕获率和其它因素决定的常数 ：电负性物质的浓度,电离惰性气体,分子,火焰光度检测器（FPD）,FPD是利用富氢火焰含硫杂原子或含磷杂原子的有机物分解，形成激发态分子，当它们回到基

16、态时，发射出一定波长的光。此光强度与被测组分成比例。所以它是以物质与光的相互关系为机理的检测方法，属光度法。 FPD是一种高灵敏度和高选择性的检测器， 只能用于含硫、磷化合物，特别是硫化合物 的痕量检测。,394nm的滤光片来检测含硫的组分 526nm的滤光片用于检测含磷的组分,氮磷检测器(NPD）,只对氮、磷有很高的选择性 氮的灵敏度：1pg/sec；磷为：0.5pg/sec 主要应用于：药物、燃料、香料、农药残留 NPD的结构类似FID，主要差别是NPD在喷嘴上方有铷珠。,化学反应原理 燃烧产生 CN 和 HPO Rb + CN Rb+ + CN- (detected) Rb + HPO

17、Rb+ + HPO- (detected),当含N、P化合物进人电离源的冷焰区，生成稳定的电负性基团(CN和PO或PO2)，电负性基团从气化的铷原子上获得电子生成Rb+与负离子CN-或PO-,、PO2-。 负离子在正电位的收集极释放出一个电子，同时物出信号。Rb+又回到负电位的物表面，被吸收还原.以维持电离源的长期使用。,三、高效液相色谱仪结构及原理,淋洗液,色谱柱,检测器,数据处理,进样器,输液泵,步 进 马 达,凸轮,排放阀,旋钮,压力传感器信号,往进样阀,排放,流动相进口,1、输液泵工作原理（FL2200）,吸液： 柱塞由泵腔向外运动从单 向阀进口向上形成较低压 力，进口单向阀被打开，

18、流动相进入泵腔。由于系 统压力大于泵腔压力，出 口单向阀被关闭，此时入 口单向阀及泵头内为低压 状态，出口单向阀处于高 压状态。,输液泵工作原理（FL2200）,输液泵工作原理（FL2200）,排液： 柱塞向泵腔内运动，进 口单向阀关闭。出口单 向阀打开，流动相进入 色谱系统。此时整个泵 全部处于高压状态。,入口 单向阀,出口 单向阀,进口单向阀安装在泵头的下部 出口单向阀安装在泵头的上部 这样有利于气泡的排出，阀体 是不锈钢的，里面装宝石小球 ， 安装在阀体进口端的是宝石 球座，在出口处装有筛网。液 体向反方向流时（从上往下） 球落入宝石球座内，阻止液体 回流。,单向阀工作原理（FL2200）,检测器工作原理（FL2200）-光路,检测原理： 基于流过 池中的样品溶 液对光产生吸 收有信号差。,朗伯比耳定律,光能量： Io=透过溶液的光能量 It=透过样品的光能量 光通量（透过率）： T=It/Io 吸光度：A=-log(T)=log(Io/It) 吸光度：A=KcL,T-浓度曲线,A-浓度曲线,低浓度样品,高浓度样品,不同种类的溶剂有其不同的截止波长 溶剂质量的好坏对其截止波长有影响 为何溶剂质量影响截止波长？ 1.含紫外吸收的杂质 2.溶解在其中的氧气 3.缓冲液溶剂的紫外吸收,谢谢！,