第七章微生物的生长及其控制.ppt

《第七章微生物的生长及其控制.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第七章微生物的生长及其控制.ppt（153页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、怎样使微生物生长，即如何培养微生物 ？ 微生物如何进行生长？ 影响微生物生长的因素是什么？ 如何控制微生物的生长？,第七章微生物的生长及其控制,纯培养：在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养,无菌操作（aseptic technique)：在微生物的分离、 转接及培养微生物时防止其被其他微生物污染的技术,（一）稀释法 1 液体稀释法 2 固体稀释法 （二）平皿划线法 （三）单细胞挑取法 （四）利用选择培养基分离法 (五）二元培养物法,一、获得纯培养的方法,1液体稀释法,适用于大型真菌 方法: 接种物在液体培养基中进行顺序稀释，得到高度稀释，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后

2、的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物,适用于大多数微生物的分离,2固体稀释法,0 1 2 3 4,涂布平板法Spread plate method,倒平板法Pour plate method,二平板划线分离法,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,Inoculating an agar plate to obtain single colonies,Mixed culture,Pure culture,a 分区划线分离法. b连续划线分离法,3.单细胞挑取法,接种针,解剖镜, ,Each colony

3、 was examined microscopically,4选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养(加富培养基),含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物 二元培养物：培养物中只含有二种微生物，而且是 有意识的保持二者之间的特定关系 例如：病毒的培养 严格的细胞内寄生,五 二元培养物,实验室的微生物培养法,好氧培养法,厌氧培养法,好氧菌液体培养法,好氧菌固体培养法,厌氧菌固体培养法,厌氧菌液体培养法,二、微生物的培养方法,液体好氧培养方法,恒温振荡培养箱

4、,实验室小型全自动发酵罐,琼脂斜面和琼脂平皿培养,香菇固体栽培床,固体好氧培养方法,焦性没食子酸，吸收氧气 通H2-CO2,驱逐氧气 加入还原剂,低氧化还原电位 制造狭小空间,厌氧培养的基本方法,高层琼脂柱,把含有还原剂的固体或半固体装入试管中,经灭菌后,除表面有一些溶解氧外,越是深层,其氧化还原电势越低.故有利于厌氧菌的生长,培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等,Brewer 皿,厌氧培养皿法,1 利用特制皿盖去创造一个狭窄的空间,再加上还原性培养基的配合使用而达到厌氧培养的目的,史(Spray)氏法:在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶

5、液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封完全，然后摇动底部，使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。,厌氧罐 anaerobic jar,使用时,先装入接种后的培养皿,然后封闭罐盖,接着采用抽真空-灌N2-灌混合气体H2-CO2,驱逐氧气.最后,灌内少量剩余氧又在钯催化剂的作用下,把灌入的混合气体中的H2还原成H2O而除去，从而形成良好的无氧环境 美蓝指示剂：由兰色变成无色,Anaerobic Glove Box,箱内始终充满着成分为:N2:CO2:H2=85:5:10的惰性气体 并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态,生产实践中微生物培养的实例,（一）微生物细胞数目的检

6、测方法 1. 总细胞计数法：血球计数板法、涂片计数法、比浊法 2. 活菌计数法：平板涂布法、倒平板法 3. 滤膜过滤法 （二）微生物生长量和生理指标的测定方法：湿重法、干重法、测定细胞的化学成分 （三）丝状微生物菌丝长度的测定方法,三、微生物生长繁殖的测定方法,原理： 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。 特点：快速，准确，在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。不适于对运动细菌的计数,血球计数法,涂片计数法,比浊法,原理:是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。 一般测定微生物浓度用的波长是: 600nm,特点：快速、简便；但易受

7、干扰。,比浊法,方法：用分光光度计测定一系列已知浓度菌液的透光度，绘出标准曲线，测定未知菌液的透光度，从标准曲线上即可查出该菌液的浓度。,比浊法,应用紫外分光光度计测定OD值,涂布平板法 倒平板法,干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100过夜)、称重。 一般干重为湿重的10%20%， 一个细菌细胞一般干重约10-1210-13g。,湿重法,将液体培养液离心,收集细胞沉淀物,然后称重,该法适合菌浓较高的样品。,生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 根据一定体积培养液中

8、的含氮量再乘以6.25，可测得粗蛋白的含量。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%， 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,微生物生长测定方法比较,测定细胞数目,测定物质量,比浊法 快速简便，敏感度低，适于不发酵液或液体中的快速 总细胞数估计，但需事先标定,（三）丝状微生物菌丝长度的测定,培养基表面菌体生长速率测定法 培养料中菌体速率测定法 单个菌丝顶端生长速率测定法,同步生长：采用一定的方法使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段叫同步生长,四、微生物的同步生长和同步培养,环境条件诱导法

9、：变换温度、光线、培养基等认为诱导控制微生物群体处于同一生长阶段 选择法：选择性过滤 梯度离心,获得同步生长的方法：,A膜过滤法,B密度梯度离心法,原理：细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤： 菌悬液通过滤膜,细胞吸附其上 反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉未结合的细胞 将过滤器放置培养 再用培养基洗脱后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,第二节 微生物的生长,生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，生命个体的重量和体积不断增大的过程。 繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 个体生长微生物细胞个体吸收营养物质

10、，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量 个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,生长与繁殖的概念,1 细菌细胞的生长 2 酵母细胞的生长 3丝状真菌菌丝的生长,一 微生物的个体生长,细菌细胞的生长：指新生的细胞长大以及最后分裂成为两个子细胞的过程 酵母的生长指：细胞体积的增加并在一定的间隔时间发生核和细胞的分裂 丝状真菌菌丝的生长：主要以极性的顶端生长方式进行,酵母细胞的生长,1、细胞二分裂生长,图 2 粟酒裂殖酵母的二分裂生长,2、细胞出芽生长,图 3 酿酒酵母的出芽生长,丝状真菌细胞的顶

11、端生长,图 4 丝状真菌菌丝细胞顶端生长模型,图 示 Allomyces macrogynus 菌丝的顶端生长,为什么要研究微生物群体生长? 因为绝大多数微生物个体微小，个体质量和体积的变化不易观察，所以常是以微生物的群体作为研究对象，以微生物群体细胞的数量或群体细胞物质量的增加作为生长的指标。,二、微生物的群体生长,（一）无分支单细胞微生物的群体生长 无分支单细胞微生物主要包括原核生物的细菌和真核生物的酵母菌 它们的群体生长是以群体中微生物细胞数量的增加来表示的，因而其生长速率就是指单位时间内细胞数目或细胞生物量的增加。,细胞呈指数增长示例,特征:每经历一个代时，细胞的数目就增加1倍，呈指数

12、增加，因而被称为指数生长，这就是无分支单细胞微生物的群体生长特征。,无分支单细胞微生物的群体生长特征,1log2 2log2 3log2,细胞数目的对数 与生长时间呈正 比直线关系,细菌研究中常用的三个参数,（1）繁殖代数（n） 指数生长方式： 1 2 4 8 2n 设接种时细胞数为x1, 时间为t1, 到时间t2后，繁殖n代，细胞数为x2，它们之间的相互关系为： x2 = x1*2n 以对数表示： x2 = x1 + n2 x2 - x1 n = = 3.322( x2 - x1 ) 2,（2）生长速度常数（R） n x2 - x1 R = = t2 t1 log2( t2 t1 ) （3）

13、代时(G) 1 t2 t1 G = = R 3.322( x2 - x1),指单位时间的分裂代数,世代:由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔 代时（eneration time, G ):一个世代所需的时间就是代时，有时也称为倍增时间,例如t0时每毫升培养液中细胞数的为104，经过4小时后该培养液中细胞数量增加到每毫升108(Nt)，则此条件该菌的比生长速率为 ： R(logNtlogNo)3.322/tt0(84)3.322/4/小时3.322/小时。 说明该菌在此条件下，每个细菌以每小时增加3.322个细菌的速度增加。,温度对代时的影响,温度对微生物的代时有明显影响： E. Coli 在不

14、同温度下的代时 温度（） 代时（分） 温度（） 代时（分） 10 860 35 22 15 120 37 17 20 90 40 17.5 25 40 45 20 30 29 47.5 77,2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线,生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的试验曲线,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,生长曲线(growth curve)描述细菌生长规律,活菌数,培养时间,.指数期,.稳定期,.衰亡期,.延滞期,细菌数

15、目（个/ml）对数,缩短延滞期的意义和方法,延滞期(lag phase),出现原因,本期特点,影响本期限长短因素,延滞期出现原因,把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要合成多种酶，辅酶，要经过一个调整和适应过程 。,Cncnc-micro,生长速率常数等于零,菌体粗大,代谢活力强,对环境变化较敏感,对不良条件抵抗能力降低,含量增加,特别是rRNA含量增高,延滞期出现的特点,菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； 接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：接种量增大可缩短甚至消除延迟期 培养基成分： 在营

16、养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短； 接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，应尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延滞期长短的因素：,.对数期（logarithmic phase）,现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点： 生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长，群体的大小、形态、生理特征等比较一致 代谢最旺盛酶系活跃 细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致,指数期生长的数学模型,繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1),菌种： 不同菌种的代时差异极大 营养成分：营养越丰富，代时越短 营养物浓度：影响微生物的生长速

17、率和总生长量 培养温度：影响微生物的生长速率,指数期的实践意义 是代谢、生理研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄 G+染色鉴定时采用此期微生物,影响指数期的因素,. 稳定期（stationary phase）,又称：恒定期或最高生长期 产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;,活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。 细菌代谢物积累达到最高峰。 芽孢杆菌这时开始形成芽孢。 这是生产收获时期。,生长速率常数R等于0,1）发酵生产形成的重要时期

18、（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。,应用意义：,. 衰亡期（decline phase）,特点： 1 细菌死亡数大于增殖数,活菌数减少 2 细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形 3 释放次生代谢产物，芽孢等 4 菌体开始自溶 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,丝状微生物包括具分支的原核生物放线菌和真核生物丝状真菌。 1. 丝状微生物群体生长的特征 这类微生物在液体培养基中虽然也可以几乎均匀分布的菌丝悬浮液的方式生长（丝状生长）。但

19、大多数情况下是以分散的沉淀物方式在发酵液中出现（沉淀生长），沉淀物形态从松散的絮状沉淀到堆集紧密的菌丝球不等。,(二)丝状微生物的群体生长,起始培养时菌丝体,培养18小时后的菌丝体,图示 丝状真菌的沉淀生长,1、生长停滞期: 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。 2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。 3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些

20、菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,三、连续培养和微生物的生长,（一）分批培养和连续培养 分批培养：指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。 通过对细菌纯培养的生长曲线的分析可知，在分批培养中培养基一次加入，不予补充，细菌的对数生长期不可能长时间维持。,连续培养：如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。 这种方法就叫连续培养法。 此法已成为当前发酵工业的发展方向,优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一 缺点：菌种易退化；易染杂菌,原理：当微生物在单批培养

21、方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,连续培养原理,连续培养:,恒化器 恒浊器,连续培养的类型,连续培养技术恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于

22、最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究,恒化器Chemostat 或bactogen,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。 特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；,连续培养技术恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,恒浊器与恒化器的比较,温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。

23、 影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响物质的溶解度，对生长有影响。,一、温度对微生物生长的影响,第三节 环境因素对微生物生长的影响,温度太低：使原生质膜处于凝固状态，不能正常进行 营养物质的运输或形成质子梯度。 温度太高：蛋白质、核酸和细胞的其他组成发生不可 逆的变形作用。 最低生长温度 三种基本温度 最适生长温度 最高生长温度,（一）微生物生长的三个温度基点,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。 超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。 超过最高生长温度时，

24、微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为5个类型：,Temperature effect: 1. 嗜冷微生物Psychrophile (0-20oC) 2 耐冷微生物 Psychrotrophs (2-35oC) 3. 嗜温微生物Mesophile (15-45oC) 4. 嗜热微生物Thermophile (45-80oC) 5. 嗜高温微生物Hyperthermophile (65-105oC),(1)嗜冷微生物（psychrophile）,最低生长温度0 以下，最适生长温度 15 ， 最高生长温度20左右；（地球两极，海洋深处）,酶系在低温下仍

25、能起催化作用其酶的二级结构含有较多的螺旋，能使酶蛋白在寒冷环境中有较强的弹性 细胞膜的脂类中不饱和脂肪酸的含量较高，在低温下膜也能保持半流动状态。,嗜冷机制：,(2)耐冷微生物(psychrotolernt),能在0 生长，但最适生长温度 2040 冷水，土壤，引起冰箱食物腐败的主要微生物类群,（3）嗜温微生物(mesophiles) ，又称中温菌,最低生长温度10左右，最适生长温度 25 37，最高生长温度45左右（大多数微生物，人类病原菌）。,(4)嗜热微生物（thermophiles）,最低生长温度45 ，最适生长温度 5060，最高生长温度80（大部分为细菌。温泉，堆肥）,（5）嗜高温

26、微生物（hyperthermophiles）,最低生长温度65 ，最适生长温度 8090，最高生长温度100以上（古生菌，热泉、火山喷气口、海底火山喷气口）,胞内酶和蛋白质在高温时更稳定（分子中1个或多个部位被某些氨基酸所取代，能以特殊的方式折叠，抵抗温度的变性作用）;,细胞质膜富含饱和脂肪酸，因而膜在高温下仍很稳定并发挥功能;,其核酸有热稳定性的结构，tRNA在特定的碱基区域含较多GC对.,嗜热机制,根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌:A 好氧菌 微好氧菌：D 兼性好氧菌C 耐氧厌氧菌：E 厌氧菌 (专性)厌氧菌B：,二、氧气对微生物生长的影响,专性好氧菌（strict

27、 aerobe）,在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性好氧菌（facultative aerobe）,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧

28、也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。 在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（ O2 ）等。超氧阴离子为活

29、性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。 好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等， 而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,H2O + O2 2 O2 + 2H+ O2 + H2O2 2H2O,O2 + e O2 ( O2 ) 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。 超氧阴离子自由基O2 普遍存在。,生物体中超氧阴离子的形成与去除,1 2,SOD 好氧生物 和耐氧细菌,过氧化氢酶 好氧生物,过氧化物酶 NADH2 NAD 耐氧菌

30、,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。 培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。 培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化还原电位势。 培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,培养措施,三、pH值,1.pH影响微生物生长的原因： 影响生活环境中营养物质的可给态和有毒物质的毒性； 影响菌体细胞膜的带电荷性质、 影响膜的稳定性及膜对物质的吸收能力；,微生物的活动也能改变环境中的PH值,大多数细菌等电点的pH值为34，而水中细菌细胞表面电荷的性质受pH值控制，即水的pH值低于细菌等电点时，细菌细胞表面带正电荷，反之

31、则带负电荷,一些微生物生长的pH值范围,2.分类： 嗜酸性微生物（pH5.4） 嗜中性微生物（pH5.4pH8.5） 嗜碱性微生物（ pH7.0 pH11.5）,1 主要是由于细胞本身具有维持胞内pH值接近中性的能力。 2嗜酸微生物在酸性环境中，细胞膜可以阻止H进入胞内、不断将胞内H排出胞外。 3嗜碱或耐碱微生物，则可以阻止OH进人胞内并将其排出胞外，以维持胞内接近中性pH。,嗜酸或嗜碱微生物耐酸或耐碱的原因：,四 比生长速率与底物浓度,莫诺经验公式表示比生长速率与生长基质浓度之间的关系:,u= umax(S/Ks+S) Umax:最大生长速率 ：生长的基质浓度 s:比生长速率为最大生长速率一

32、半时的基质浓度,同一种基质中s是一个常数它通常值很小 当很高时，s可以忽略不计Ks+S 此时u= umax 如对数期 当很低时， Ks+SKs 此时u= umaxS/Ks,总生长量,总生长量代表在某一时间内，通过培养所获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差值，它的大小客观上也反映了培养基与生长条件是否适合于菌的生长,产量常数（Y）总生长量所消耗基质的总量 Yt t,Y值大小代表微生物对基质同化的效率，反映了微生物利用某种基质生长的效果，因此在生产实践中应采取有效措施，提高Y值以创造更大的经济效益。,灭菌（sterilization） 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生

33、长繁殖能力的措施，称为灭菌。 消毒（disinfection） 采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。杀死、消除或降低病源微生物 防腐（antisepsis） 防止或抑制微生物的生长 化疗（chemotheraphy） 即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。,第四节 微生物生长繁殖的控制,控制微生物的方法,高温（干热灭菌、湿热灭菌和巴斯德消毒法） 低温（冷藏法5和冷冻法-10 ） 物理方法 辐射（紫外光、电离辐射和强见光） 干燥和渗透压 过滤 消毒剂和防腐

34、剂 化学方法 化学治疗剂 微生物的抗药性,1、高温灭菌法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,一、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法,（一）温度,干热灭菌,烘箱热空气法： 温度：171 1h，160 2h，120 12h 用途：玻璃器皿、金属器皿等 优点：保持灭菌物品干燥 火焰焚烧法： 优点：灭菌彻底、迅速、可靠、简单 用途：接种工具、污染物品、动物尸体等,特点：温度低、时间短、灭菌效果高 原因： 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强； 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，

35、主要破坏氢键结构。,湿热法(moist heat sterilization),热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强,高压蒸汽灭菌 (normal autoclving),是湿热灭中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的压力下面（此时温度121）处理15 30min,注意事项： 排净冷空气；否则会形成假压，虽然压力达到要求，温度却达不到相应高度，而影响灭菌效果 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。 在水中加入的a2CO3或的碳酸效果更好。 此法适合注射器和解剖用具的消毒。,煮沸消毒法,一般用于饮

36、用水的消毒。,低温长时法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min处理牛奶 高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处理牛奶 超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在134左右3-4s，急剧冷却至75，经匀质化后冷却至20。,巴斯德消毒法（Pasteurization）,用较低的温度处理不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料，以杀灭其中的无芽孢病原菌，又不影响其原有风味的消毒方法。,适用于牛奶、啤酒、果酒和饮料等液态食品,间歇灭菌法：,是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法

37、 主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热的药物和营养物等 方法是将待灭菌物品置于蒸锅内加热到沸腾维持15 30min杀死营养细胞，取出冷却后在37恒温培养24h，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反复三次，即可达到灭菌目的。,原理:低温低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。 冷藏法：5，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜 冷冻法：食品工业中采用-10左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，如-80低温冰箱、或-80液氮中冷冻保存。,二、低温抑菌,冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。 冻结过程造成细胞脱水。 缓慢冻结，形成

38、的冰晶大，对细胞损伤大； 快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏. 措施:在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。,温度过低会造成微生物死亡,原理:采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，达到灭菌的目的。但不能除去病毒。 实验室中常用的滤器： 过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜； 以及石棉板等。 滤器孔径：常用0.22 m 、0.45 m 。 应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌。,（三）过滤除菌法,（三） 过滤作用,空气和

39、不耐热的液体培养基的灭菌,棉花、玻璃纤维或石棉,滤膜,核孔,紫外线（非电离辐射） X射线与r射线 可见光,（四）辐射,紫外线（非电离辐射）,诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制, 紫外线 O,波长在100400nm的电磁辐射波，200200nm的紫外线对微生物的作用最强，主要作用于核酸引起T=T形成。此外，紫外线还能使空气中的氧变为臭氧，臭氧分解放出的强氧化剂新生态氧O，也有杀菌作用,各种微生物对紫外线抗性,干细胞强于湿细胞 芽孢，孢子强于营养细胞 多倍体 二倍体 单倍体,特点是穿透力差，故仅适于直射物品表面消毒及空气消毒,X射线与射线(电离辐射),1撞击分子时，能从分子中逐出电子

40、而使之电离。 2电离辐射的杀菌作用是间接地通过射线激发环境和细胞中的水分子，使水分子在吸收能量后被电离产生自由基 3自由基(OH. H.)再作用于生物分子,打断氢键,使双键氧化破坏和改变生物大分子的结构,强可见光,波长400nm-700nm的强可见光具有直接杀菌作用,(五)干燥和渗透压,干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高，从而抑制生长或造成微生物死亡,干 燥,渗透压,等渗溶液对微生物生长有利,细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂,细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离 导致死亡,二 化学方法的控制,消毒剂和防腐剂 化学治疗剂,抗微生物剂,非选择性 （对所有细胞均有毒性）,有选择性

41、 （对病原微生物毒性更强）,消毒剂(Disinfectant),防腐剂(Antisepsis),抗代谢药物,抗生素,生物药物,（化学治疗剂）,一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质,特点： 对一切活细胞都有毒性，不能用于人或动物体内的化学治疗。,消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。,防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组 织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。,非选择性,消毒剂和防腐剂,醇类 醛类 酚类 表面活性剂类 染料 氧化剂类 重金属类 酸碱类,醇 类,原理：脱水剂、脂溶剂、蛋白质变性、脱水 主要用于皮肤及器械消毒。 丁醇丙醇乙醇甲醇 丁醇以上

42、不溶于水，甲醇毒性很大，通常使用乙醇 以7075%的乙醇溶液效果最好 浓度高，表面蛋白质凝固，形成保护膜,醛 类,原理：醛的还原作用使蛋白质的-NH2还原而变性 3740%的甲醛水溶液，即福尔马林。 用途：空间、表面的消毒。常用2%浸泡器械；10%空间消毒,酚 类,原理：使蛋白质变性，破坏膜通透性，杀菌或抑菌 甲酚：杀菌力强。 用途：35%的来苏尔（煤酚皂液：甲酚和肥皂的混合液 ）用于表面消毒；25%石炭酸用于器械消毒，0.51%石炭酸用于粪便、空气和皮肤消毒,表面活性剂类,原理：能吸附在细菌表面，改变细胞壁、细胞膜透性，引起蛋白质沉淀 用途：低浓度抑菌，高浓度杀菌，去垢,染 料,在一定浓度下

43、，碱性染色剂都有抑菌效应，而不杀菌。有的碱性染色剂与-COOH或H3PO4作用，可杀菌 干扰菌体代谢，如丫啶类染料可嵌入DNA螺旋结构，影响复制,氧化剂类,O可以破坏-S-S-，使酶、蛋白质失活而抑菌或杀菌。如KMnO4、H2O2、Cl2、Ca(ClO)2等 卤素及其化合物：常用Cl、I的氧化作用强，杀菌 Cl2及氯化物：如漂白粉：CaCl2Ca(OH)2Ca(ClO)2,Ca(ClO)2+2H2O Ca(OH)2 + 2HClO,HClO HCl + O,Cl2 +H2O HCl +HClO,I2的原理：氧化作用，还可与Tyr结合，使蛋白质变 性 碘酊,重金属类,是杀菌剂和防腐剂，作用最强的

44、是Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活。（与E的SH结合。） 00202Hgcl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用 011 AgNO3 可消毒皮肤，1浓度新生儿点眼预防眼炎 CuSO4对真菌、藻类有强杀伤力，波尔多CuSO4碳酸钙）防植物病害 另外还有砷的化合物是治疗梅毒的特效药,酸和碱,前面讲过微生物细胞中的DNA，RNA，蛋白质，酶只有在中性条件下才能体现活性， 因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。,概念：指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性的化学药剂，对人体几乎没有什么毒性或毒性很小，可用作治疗微生物引起的疾病。 既适用于涂抹肌体表面，也始于通过口服或

45、注射吸收到体内。 种类： 抗代谢物 抗生素 3. 生物药物,（二）、化学治疗剂,有选择性 （对病原微生物毒性更强）,抗代谢物,有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相 似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功 能，干扰代谢的正常代谢，这些物质称为抗代谢物,二氢蝶啶 + 对氨基苯甲酸 二氢叶酸 四氢叶酸 辅酶F 磺胺药 核酸合成,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸还原酶,磺胺药作用机理：,细菌需要利用对氨基本甲酸合成生长所需的叶酸：,是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。,抗生素(ant

46、ibiotic),抗菌谱,广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素） 窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素）,青霉素抑制藤黄微球菌的生长,每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱,抗生素的诞生,1928年A.Fleming发现青霉素 1940弗罗里提纯出青霉素 各种抗生素被相继发现并应用 人工合成半合成抗生素被相继开发出来 抗生素的分类 抗生素的作用机制,英国科学家A.Fleming爵士,青霉素的发现者,抗生素史话,当时弗莱明并无法将青霉素纯化出来，因此他只能以含有微量青霉素的粗培养液进行实验，虽然这些粗培养液能够有效杀死试管中的细菌，但当喂食给被细菌感染的兔子或老鼠时，却发现无抑菌

47、的能力。 这样的实验结果，使得弗莱明认为青霉素在动物体内无法继续维持其杀菌的效力，因此在发表几篇论文后，就终止了这个研究，使得抗生素的发展停顿了将近十年之久。,与弗莱明共同获得1945年诺贝尔生理学和医学奖.,1940提纯出青霉素,澳大利亚病理学家霍华德.弗罗里,青霉素的发明者,人工合成半合成抗生素被相继开发出来,6-氨基青霉烷酸,抗生素的分类,作用机制： 1）抑制细胞壁的合成；（如：青霉素） 2）破坏细胞膜功能；（如：多粘菌素可作用于膜磷脂使膜溶解） 3）抑制蛋白质合成；（如：氯霉素，四环素、链霉素等） 4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、新生霉素、丝裂霉素、灰黄霉素） 5)作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化,2、作用机制,（三）微生物的抗药性,微生物产生抗药性的机制有6种： 结构发生改变导致某类药物作用的结构缺失 细胞膜对药物的通透性和吸收能力降低, ； 激活膜上抗药泵蛋白将进入到胞内的药物泵出胞外 合成某种酶将化学治疗剂被变为无活性的形式， 药物受体的亲和性或数量下降 被药物阻断的代谢途径发生遗传改变,白点是强度各异的抗生素，最底下的青霉素完全没有黑环，显示它对链球菌已毫无作用,抗生素的抗药性