第七章细菌和病毒的遗传.ppt

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1、,第七章 细菌和病毒的遗传,第一节 细菌和病毒的结构,第二节 细菌的遗传分析,第三节 噬菌体的遗传分析,第一节 细菌和病毒的结构,细菌和病毒的结构及其遗传特点，使它们成为遗传学研究的好材料。转化试验、一个基因一种酶假说、基因的精细结构、基因表达的调控、基因工程等遗传学的重大发现和技术发展都与细菌和病毒有关。,一、细菌的结构,单细胞生物，大小不一，一般长1- 2m，宽0.5m，为一层或多层膜或细胞壁所包围。部分细菌还有某些特殊的结构，如鞭毛、伞毛、荚膜等。 细菌的细胞核没有核膜，其中的染色体是一个很长的共价闭合环状双链DNA分子，长度从250-3500m不等，一般不与蛋白质结合。 多数细菌细胞在

2、细胞核外还有一个或多个能自主复制的小型环状DNA。这些DNA分子对细菌的生长并非必需，但可赋予细菌某些特性，如抗药性、抗盐性、抗噬菌体侵染等。这些小分子DNA称为质粒（plasmid）。 细菌能在成分十分简单的培养基上生长，这种培养基叫基本培养基。细菌在这种培养基上能合成生长所必须的各种有机物。单一细胞经过分裂而增殖，大致20分钟繁殖一代，逐渐形成肉眼可见的菌落。,二、病毒的结构,病毒为非细胞结构，没有自身的代谢机能，不能独立地生长和繁殖，必须寄生在活细胞中，利用活细胞的营养物质合成新的病毒后代。繁殖迅速，每小时可增殖百倍。 病毒个体微小，形态多样，结构简单，仅含一种核酸（DNA或RNA）和一

3、个蛋白质外壳。依其遗传物质的性质，可以分单链DNA、单链RNA、双链DNA和双链RNA病毒等四种类型。按照它们所感染的细胞类型可分为感染细菌、真菌及藻类的菌类病毒，以及感染动植物的动物病毒和植物病毒。 遗传学研究中应用最广泛的是感染细菌的病毒，又称为噬菌体(bacteriophage)。依其与宿主细胞的相互关系，可以分为烈性噬菌体(virulent phage)和温和噬菌体(temperate phage)两大类型。,1世代周期短： 大肠杆菌(E. Coli)20分钟可繁殖一代。 2便于管理和生化分析： 个体小，一般在1m至几m之间(1m=1/1000mm)，操作管理方便。 3便于研究基因突变

4、： 裸露的DNA分子(有的病毒为RNA分子)，易受环境条件的影响而发生突变；单倍体生物，不存在显性掩盖隐性问题，突变均能表现出来。,三、细菌和病毒在遗传学研究的优越性,4便于研究基因的作用： 影印培养，易检出营养缺陷型突变，有利于从生化角度来研究基因的作用。 5便于基因重组研究： 细菌具有转化、转导和接合作用，利用这些特性可以进行精密的遗传学分析 6. 便于研究基因结构、功能及调控机制： 细菌和病毒的遗传物质简单，基因定位、结构分析及其分离易于进行，基因的表达调控也适于用生理生化的方法进行深入的研究。 7. 便于进行遗传操作： 染色体结构简单，没有组蛋白和其它蛋白的结合，更宜于进行遗传工程的操

5、作。,四、细菌和病毒的研究方法,1单细胞分离 菌液稀释涂布在固体培基单个细胞分离形成肉眼可见菌落。,细菌的研究方法：,2影印法测定变异 采用影印法测定细菌是否发生变异以及发生何种变异。 细菌变异主要有形态特征变异和生理特性变异。 形态特征变异：菌落大小、形状、颜色 生理特性变异： （1）营养缺陷型：丧失合成某种营养物质的能力，在基本培养基上不能生长。 原养型（野生型）：能够在基本培养基上生长。 （2）抗性突变：抗药性和抗感染型。,细菌的影印培养方法（Lederberg, 1952）,病毒的研究方法： 1. 获得变异 亚硝酸、羟胺、乙基黄酸乙酯（EES）等化学药剂诱导发生变异。 常见变异： 寄主

6、范围变异：野生型（h）：感染B菌株，产生半透明斑；突变型（h）：感染B和B/2菌株，产生透明斑。 噬菌斑突变：野生型（r）：产生正常斑，小而边缘模糊；突变型（r）：产生突变斑，大而边缘清晰。 所以：h+r感染B菌株产生半透明大斑；hr+感染B和B/2菌株，产生透明小斑。 2杂交试验 双重感染分析子代噬菌体中重组型的频率。,1. 转化（transformation）：裸露的非病毒的DNA导入细菌细胞的过程。 2. 转染（transfection）：裸露的病毒（噬菌体）DNA导入细菌的过程。是一种特殊的转化形式。 3. 转导（transduction）：以噬菌体为媒介将细菌的DNA从供体菌转移到受

7、体菌的过程。 4. 接合（conjugation）：细菌通过细胞之间的直接接触的方式传递遗传物质的过程。,一、细菌遗传物质的转移形式,第二节 细菌的遗传分析,通过接合作用，部分供体基因组DNA转移到受体菌中,通过接合作用，质粒转移到受体菌中,1. 单方向转移 2. 都产生部分二倍体 3. 转入的基因只有整合到环状染色体上才能稳定遗传,二、细菌遗传物质转移的共同特点,三、细菌的转化（transformation）,1. 转化的发现,1928年F. Griffith首先发现。1944年O. Avery研究小组证实引起转化的因子是细菌的DNA。,转化(transformation)：细菌细胞通过其细

8、胞膜摄取周围供体DNA片段，并通过重组整合到自己染色体中的过程。,2. 转化的类型,（1）自然转化（natural transformation）,细菌可以自由吸收DNA，并转化。如：枯草杆菌的转化。,（2）工程转化（engineered transformation）,人工转化 (artificial transformation) 细菌发生改变(感受态细胞的制备)，使其能摄入外源DNA，并转化。如：大肠杆菌的转化。,3. 转化的过程,（1）外源DNA与受体细菌细胞的结合 影响因素： 供体DNA片段大小：不同细菌要求转化的片段大小不同。肺炎双球菌要求800核苷酸对以上；枯草杆菌要求1600核

9、苷酸对以上；大肠杆菌转化DNA片段长度为10000-20000bp（占E.coli染色体的1/200）。 供体DNA片段形态：供体DNA必需是双链。 供体DNA片段浓度：供体DNA片段数目越多越容易发生转化，但不同细菌只能与特定数量DNA片段结合。取决于细胞上接受座位数。一个细菌表面大约有50个吸附位点。 受体细胞生理状态：感受状态细胞（DNA合成刚结束，蛋白质合成仍在进行时的细胞）才能发生转化。感受态的出现主要受一类小分子蛋白质（感受态因子）影响，感受态因子可以使细胞出现感受态，并能从感受态细菌传递到非感受态细菌，使其出现感受态。一般认为感受态出现在细菌对数生长后期。高Ca2+、温度以及电激

10、处理等，也能够改变膜对DNA的通透性，从而诱导或加强感受态。,b）DNA通过细胞壁和细胞膜是一个主动运输过程，需要膜上的转运分子，并消耗能量。,（2）DNA的穿入,a）在细胞膜上核酸外切酶的作用下，将吸附双链DNA中的一条链降解，另一条单链则利用降解后释放的能量，穿入受体细胞内。,（3）联会(synapsis)，与外源DNA片段的整合,联会：外源单链DNA与受体细菌染色体DNA的同源区段发生联会 ，形成部分二倍体。 部分二倍体：细菌拟有性生殖过程中，外源DNA与受体DNA同源区段联会，使受体细胞部分DNA形成二倍体。 供体外基因子：部分二倍体中的外源DNA。 受体内基因子：部分二倍体中受体细胞

11、的DNA。 整合（重组）：部分二倍体发生交换，将外源DNA置换到受体染色体中。,部分二倍体发生交换只有偶数（双交换、四交换）交换才有意义，既不破坏受体DNA的环状结构，又将外源DNA置换到受体染色体中。而奇数交换将受体环状DNA打开成线性DNA，重组转化子不能成活。,经过一次染色体复制和细胞分裂，形成一个转化了的细胞和一个未被转化的细胞。,（4）转化细胞的形成,细菌转化的过程,整合,外源DNA结合在受体位点,DNA穿入,感受态细胞,联会,形成转化细胞,4. 转化作图,DNA是以小片段的形式进入受体的，所以距离很远的两个基因很难同时存在于一个片段中同时转化，除非分别包括这两个基因的两个片段同时进

12、入受体。两个片段同时转化的概率应为它们单独转化的概率的乘积。但是当两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体中，因此，紧密连锁的基因可以通过转化进行作图。通过转化实验，利用转化发生的重组计算它们之间的重组率，将细菌的不同基因定位在它的染色体DNA上，构成它的遗传图谱。,用一野生型细菌菌株提取出来的DNA转化一个不能合成丙氨酸（ala）、脯氨酸（pro）、精氨酸（arg）的突变菌株，获得下列结果： ala+ pro+ arg+ 8400 ala+ pro arg+ 2100 ala+ pro arg 840 ala+ pro+ arg 420 ala

13、pro+ arg+ 1400 ala pro arg+ 840 ala pro+ arg 840,任意两基因发生共同转化的前提下：,ala-pro：亲型转化子：ala+pro+ 重组型转化子：ala+pro- ala-pro+ ala-arg：亲型转化子：ala+arg+ 重组型转化子：ala+arg- ala-arg+ pro-arg：亲型转化子：pro+arg+ 重组型转化子：pro+arg- pro-arg+,重组率重组型转化子/转化子总数100 alapro间的重组率 (2100+840+1400+840)/(2100+840+1400+840+8400+420) 37 alaarg间

14、的重组率 (840+420+1400+840)/ (840+420+1400+840+8400+2100) 25 proarg间的重组率 (2100+420+840+840)/(2100+420+840+840+8400+1400) 30% 所以，三基因间的距离和顺序为： ala25arg30pro,四、细菌的接合（conjugation）,E. coli接合的发现,1946年Joshua Lederberg（黎德伯格）和Edward Tatum发现了细菌之间通过直接接触传递遗传信息。,Lederberg由于研究细菌的重组而获得1958年Nobel Medicine or physiology

15、 Prize。,Tatum和G.W.Beable提出的“一个基因一个酶”也在此奖中。,1. Lederberg-Tatum实验 Lederberg发明的用基本培养基（minimal medium）筛选原养型（prototroph）方法。,对照（control）,实验解释：基因突变；营养物质互补；遗传物质重组？,对实验结果的解释,Lederberg和Tatum从概率上和对照实验上排除了细菌发生恢复突变的可能性：,a）单一性状恢复突变率是10-7，双性状恢复突变的概率是10-14。,结论：,在A菌株与B菌株之间发生了遗传物质的交换。 营养物质互补：营养缺陷型细菌通过培养交换营养物质，相互补充了对方

16、的不足而得以在基本培养基上生长。,b）对照培养的A、B菌株都没有生长出菌落。,对Lederberg-Tatum实验解释的质疑,（1）实验获得的原养型重组菌可能是转化的结果。 （2）营养物质的互补：培养基中含有某些代谢产物，混合后互相补充了对方的缺陷而得以生长。,Lederberg和Tatum的补充试验,A（或B）菌株,基本培养基中培养,细菌滤器过滤,滤液,B（或A）菌株,基本培养基中培养,不能生长,Bernard Davis实验的支持:是遗传重组，而不是营养物质互补，但需要亲本细胞的接触。,Hayes（海斯）实验,strain A,链霉素处理,strain B,strain A,在基本培养基中

17、有菌落,接合：指两菌体细胞的直接接触，遗传物质从一个菌体转移到另外一个菌体，并导致遗传重组的过程。,2.接合,1952年Hayes用链霉素处理菌株A，然后和菌株B杂交，有遗传重组发生，反之，则无重组的产生，说明细菌遗传物质的交换不是交互的，而是单向的-F因子,实验推论,strain B,链霉素处理,strain A,strain B,在基本培养基中没有菌落,链霉素只阻止细菌分裂，但允许接触杂交。, 供体：,strain A虽然被阻止分裂，但仍然能完成杂交（给出DNA），结果产生分裂形成的原养型菌落。,结论:,strain B 被阻止分裂，也能完成杂交（接收DNA），但不能分裂形成原养型菌落。,

18、 受体：,两个菌株在杂交过程中的作用不是交互的，而是单向的，DNA只能从供体转移到受体。,Hayes等对“雄性”细菌和“雌性”细菌的解释,（1）供体（donor）菌株：,（2）受体（recipient）菌株：,“雄性”菌株：细胞内含有一种致育因子（fertility factor），表示为F +。,“雌性”菌株：缺乏F因子，表示为F -。,从逻辑上预言了F因子（F factor）的存在。,F因子的实质,F factor：是一种质粒，有独立自主复制和能够转移到其它细胞中去的能力。是一种共价闭合环状DNA，全长94.5kb。,质粒（plasmid）：存在于细菌染色体以外的DNA。对细菌的生存并非必

19、须，但能给细菌带来一些额外的功能（如抗菌素抗性等）。,F因子的结构,大肠杆菌的接合过程（F+F- ）：F因子的转移频率高，而细菌DNA转移频率极低。,F+F-,(1)F+与F-混合培养相互接触，F+供体菌上的性伞毛形成两细胞之间的接合管,(2)核酸内切酶在F因子的转移起点（oriT）的一条链上产生一个缺口，然后5末端单链通过接合管进入受体细胞,(3)F因子上的单链DNA和正在转移的单链DNA，各自为模板，在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA,(4) 完成F因子向受体细胞转移以及DNA的合成,(5)在DNA连接酶的作用下完成接合，形成两个F+细胞,3. 高频重组菌株（Hfr）,1950年Luca

20、 Cavalli-Sforza（卡瓦里斯弗所）用氮芥（nitrogen mustard）处理A菌株，从存活下来的菌中分离到一株能与B菌株以10-4频率杂交的菌株，称之为Hfr（high frequency recombination）。,F+ F-,F+,Hfr F-,F-,低频率重组，10-7,高频率重组，10-4,高频重组与F因子的关系,（1）Hfr与F factor的异同处：, 都能与F-杂交, 杂交时都要通过接合的形式, 高剂量的链霉素处理不影响杂交, 产生的重组菌落的频率不同, F+ F-的后代是F+ ； Hfr F-的后代是F-, F+经吖啶橙处理变成F-；而Hfr经丫啶橙处理仍为

21、Hfr，能与 F-杂交,相同点,不同点,部分二倍体,F因子整合到染色体上，形成Hfr，由于F因子整合在细菌染色体的位置和方向是随机的，所以存在许多不同的Hfr菌株。 Hfr F-：细菌DNA转移率很高，F因子转移率很低。,Hfr染色体上F因子的转移起点被核算内切酶切开，以一小段FDNA首先进入受体细胞，然后是染色体DNA,1.两细胞接触，供体性伞毛形成接合管，整合的F因子产生缺口。单链通过接合管转移到受体细胞（F因子的转移原点及附近的供体基因）； 2.转移的部分Hfr染色体与完整的F-染色体，形成部分二倍体； 3.通过双交换，供体基因整合在受体基因组上。如果部分二倍体中发生单交换或奇数的交换，

22、则受体内基因子由环状变为线状，导致细菌死亡。,Hfr F-,部分二倍体：转移的供体染色体称为供体外基因子，而受体的完整染色体称为受体内基因子。转移染色体的长度一般限制在供体染色体总长的1/2以内。,线性DNA片段被降解,4. F因子和性导(sexduction),F因子的形成,在Hfr细胞中，染色体上的F因子是相当稳定的，但F因子也能够低频率地从细菌染色体上切除，偶尔会形成携带部分细菌染色体基因的F因子，阿代尔伯格和伯恩斯（Adelberg和Burns ，1959年）称该因子为F因子。,性导(sexduction)： 指F因子所携带的细菌染色体DNA，通过接合作用转移到受体细菌染色体中，从而改

23、变受体遗传性状的过程。 性导在受体细菌中可形成部分二倍体。,基因AE形成部分二倍体,通过接合作用转移到受体细菌染色体,F因子携带细菌染色体DNA,形成的部分二倍体可发生一下几种情况：,2、若发生重组，即F因子所携带的供体细菌染色体同受体细菌染色体之间发生了同源重组，,1、这种部分二倍体若不发生重组，那么F因子可在细菌细胞中自主的延续下去；,1）如果发生单交换，会导致F因子整合到受体染色体上而形成Hfr品系，同时F因子上所携带的供体基因也发生重组；,2）如果发生双交换，使F因子上的细菌基因与受体染色体上等位基因之间发生互换，形成的F品系和重组的细菌染色体。,5. F 因子与F-、F+、Hfr、F

24、的关系,1）F+与F-关系：当F+ 和 F-接合过程中，它们之间形成接合管，使受体获得了F因子而成为F+ 菌。F因子以高频率从F+菌向F-菌转移，而染色体基因的转移则很少发现，重组频率大约只有10-7，因此F+菌称为低频重组型 (low frequency recombination，Lfr)。 2） Hfr与F-关系：当Hfr与F-的接合过程中，首先形成接合管，使供体染色体转移给受体，形成高重组频率（10-4），因此 Hfr菌称为高频重组型 (high frequency recombination strain，Hfr)。 3）Hfr 与F+、 F关系：Hfr与F+菌株可以相互转变，F因子

25、既可以插入到染色体中去（Hfr），又可以通过规则的交换和剪切，从染色体上完整地游离下来（F+）。 F因子在从染色体上剪切时偶尔也会出现不规则分离的结果，使F因子携带一段相邻的细菌染色体，这种带有插入细菌基因的环状F因子称为F因子。F因子即能高频地转移质粒DNA，也能高频地转移细菌DNA。,1.中断杂交法作图,中断杂交（interrupted mating technique)：1957年，Ellie Wollman（沃尔曼）和Francois Jacob（雅各布）建立了一种绘制E.coli遗传图的方法： 1） Hfr与F-杂交，在混合后的不同时间进行搅拌，使接合管断裂，终止染色体向F- 细胞移

26、动； 2）稀释后接种到含有链霉素培养基上，杀死Hfr ； 3）影印到各种选择性培养基（selective media）上，以某供体基因作为选择标记，测定其进入受体后其他非选择性标记基因进入F-细菌的顺序和时间。,五、细菌的重组频率和遗传作图,作图原理,越是靠近转移起点（原点）的基因越早发生转移，混合培养时间越少。在不同的时间中断杂交，根据不同基因的转移时间就能推断出基因的顺序。,Hfr与F混合培养不同时间取样 搅拌中断杂交 稀释 含链霉素完全培养基 杀死Hfr 抗str菌落 影印培养鉴定azi+tongallac各基因转移时间。 混合培养9分钟，出现azi； 混合培养11分钟，出现azi和to

27、n； 混合培养18分钟，出现azi、ton和lac； 混合培养24分钟，4种原养型都出现。 o azi ton lac gal F 9 11 18 24,Hfr：strs（抗链霉素）、azi+（抗叠N化合物）、ton+（抗T1噬菌体）、gal+（半乳糖原养型）、lac+（乳糖原养型） F：strr（链霉素敏感型）、azi-（叠N化合物敏感型）、ton-（T1噬菌体敏感型）、gal-（半乳糖缺陷型）、lac-（乳糖缺陷型）,E.coli的染色体是环状的,Wollman和Jacob用4个不同的Hfr菌株同F - 进行中断杂交，得到的基因排列顺序相同，但是进入的时间早晚（重组率）不同。,解释,Hfr

28、染色体上F因子的整合位点不同，整合方向也不同;,传递的起始点不同。,E.coli的染色体是环状的。,2.重组作图,部分二倍体，只有偶数交换才能产生平衡重组配子，相反的重组子不出现。,部分二倍体,重组作图 （recombination mapping） 是根据基因间的重组率进行基因定位。,下面通过实例来加以说明：,例如根据中断杂交试验，已知大肠杆菌的甲硫氨酸缺陷型（met-）、精氨酸缺陷型（arg-）、亮氨酸缺陷型（leu-）这三个基因是紧密连锁的，而且就某特定的Hfr菌株来说，基因的转移的顺序是met+、 arg+ 、leu+,Hfr met+ arg+ leu+ strs F- met- a

29、rg- leu- strr,含链霉素并添加精氨酸以及甲硫氨酸的培养基上（在这种培养基中，杀死所有的Hfr细胞和未杂交的F-细胞）。在这种培养基中形成菌落的重组子基因型应该是leu+ strr 。,已经筛选出的leu+ 重组子，用影印法测定其余两个非选择标记基因以及他们的菌落数。测定结果如下：,基因型 菌落数 基因型 菌落数 leu+ arg- met- 16 leu+ arg+ met- 36 leu+ arg+ met+ 348 leu+ arg- met+ 0,基因型leu+ arg- met+ 是四交换的结果，与双交换相比，其交换频率非常低，在本次实验中未能检测到该重组基因型 。,16,

30、36,348,0,根据上述接合结果，基因间的重组率可用下式计算： leu - arg 的重组率=（leu+arg-met-）+（leu+arg-met+）/ （leu+arg-met-）+（leu+arg+met-）+（leu+arg+met+）+（leu+arg-met+） 100% =16/16+36+348=4% arg-met 的重组率=（leu+arg+met-）+（leu+arg-met+） / （leu+arg-met-）+（leu+arg+met）+（leu+arg+met+）+（leu+arg-met+） 100% =36 / 16+36+348= 9% leu-met 的重

31、组率= （leu+arg+met-）+（leu+arg-met-）+ （leu+arg-met+）/ （leu+arg-met-）+（leu+arg+met-） +（leu+arg+met+）+（leu+arg-met+） 100% =16+36/16+36+348=13%,重组作图的重组频率 (RF) 所测得基因间距离与中断杂交以时间 (T) 为单位获得的基因间距离基本上相一致； 1个时间单位（1分钟）相当于20%重组值 (或20 cM)。,大肠杆菌遗传图谱和物理图谱的比较 图a表示1990年绘制的遗传图谱中近60分钟到61分钟的标记基因； 图b表示每个基因在大肠杆菌完整基因组序列中的精确位

32、置。,中断杂交法和重组作图绘制的大肠杆菌遗传图(1963),map units in minutes,第三节 噬菌体的遗传分析,一、噬菌体的生活周期,(一) 烈性噬菌体,1. 噬菌体吸附到宿主细胞上 2. 尾丝鞘收缩，中轴刺穿宿主细胞 3. 头部的DNA被送入宿主细胞 4. 在数分钟内，所有的细菌核酸和蛋白质合成都被抑制。,5. 噬菌体大分子合成，细菌的核酸被降解。,（1） 噬菌体DNA复制。 （2） 噬菌体外壳蛋白合成。,(1) DNA被包到头部 (2) 组装尾部 (3) 装上尾丝,6. 噬菌体组装,约200个噬菌体导致细菌被噬菌体基因编码的溶菌酶（lysozyme)溶解。,7. 宿主细胞破

33、裂,烈性噬菌体,(二)温和性噬菌体,侵染细菌,原噬菌体（ 噬菌体）溶源途径,进入溶菌阶段,理化因素作用 ，原噬菌体脱离宿主染色体而进入裂解途径。,裂解寄主而释放,溶源细菌细胞分裂，溶源性稳定遗传,噬菌体吸附在细菌上，将染色体注入宿主细胞内,溶源途径,溶菌途径,二、噬菌体的基因重组,.噬菌体表型的区分,噬菌体突变影响生活周期，会产生不同的噬菌斑。噬菌斑是噬菌体感染宿主细菌后，在细菌涂布平板培养基中形成的，肉眼可见的透明圈。1个噬菌斑大约含有107个噬菌体，它们起源于同一个噬菌体，是噬菌体反复侵染、裂解细菌后产生的噬菌体后代，因此有着相同的基因型。通过观察噬菌斑的形态来鉴别噬菌体的基因型。, 噬菌

34、斑的形态：（T2噬菌体）, 宿主范围：,h（突变型）：噬菌体能在E.coli B和B/2品系上生长,h+（野生型）：只能在E.coli B品系上生长。,能在B和B/2混合菌苔上产生透明斑。,感染B菌株，产生半透明斑。,r（突变型）：快速溶菌，噬菌斑大，边缘清楚。,r+（野生型）：噬菌斑小，边缘模糊。,、噬菌体杂交,亲本噬菌体（T2）基因型,hr+：透明，小斑，边缘模糊,h+r：半透明，大斑，边缘清楚，,杂交过程混合感染实验,两个亲本噬菌体混合感染E.coli B和B/2，观察菌苔上出现的噬菌斑特征，用以推断噬菌体的基因型。,hr+h+r,hr+和h+r噬菌体同时感染E.coli B,噬菌体DN

35、A复制、重组,产生亲本型和重组型子代噬菌体,半大,半小,透小,透大,上述子代噬菌体接种在同时长满大肠杆菌B和B/2的混合培养物中,根据噬菌斑点形态识别噬菌体基因型,hr+h+r中在B和B/2混合菌苔上出现了4种噬菌斑。,、噬菌体重组值与基因作图,重组值的计算,重组噬菌体的噬菌斑数,总噬菌斑数,100%,基因图距,用两个基因的重组值表示基因间的距离。,Hershey和Rotman1949年的T2杂交结果,r,h,24,4. 重组机理,h+r,h+r,h+r,h r+,h r+,h r+,h+r,h+r,h+r,hr+,hr+,h r+,噬菌体染色体在细菌体内复制,不同的噬菌体染色体在细菌体内交换

36、重组,h+r,h+r,h+r+,h+r,h+r,hr+,hr+,h r,h+r,h+r+,h+r,h r+,h r,h+r,释放出的4种子代噬菌体,部分噬菌体DNA重组,噬菌体也可以通过类似于高等生物三点测验进行基因定位。如用T4噬菌体的两个品系混合感染大肠杆菌。一个品系是：小噬菌斑（m）、快速溶菌（r）、混浊噬菌斑（tu）；另一品系对这三个性状都是野生型（+），混合感染大肠杆菌,与真核生物不同，病毒只具有一条染色体，亲本组合与重组合可直接从后代中反映出来。所得后代8种类型中数目最少的两个就是双交换的结果，频率最高的两个是亲本类型，其余的为单交换类型。根据表中结果，我们就能计算这三个基因间的重

37、组以及符合系数。表中结果可知：m- r的重组率为12.9%，r- tu的重组率为20.8%，m- tu的重组率为27.1%，因此，m 、r 及tu基因的排列顺序为：m r tu。 由此可见，利用混合感染试验的结果，可以将噬菌体的基因定位在染色体上，制作噬菌体的连锁遗传图。Streisinger和Edgar根据许多基因重组的资料，在1964年确定噬菌体的染色体是环状的。,噬菌体的遗传图,1.转导的发现,1952年，J. Lederberg和他的学生N.Zinder（津德）在鼠伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium）中作的重组实验：,菌株,Strain LA-2：,phe+ t

38、rp+ met - his-,Strain LA-22：,phe- trp- met + his+,三、转导(transduction),Transduction:以噬菌体为媒介，将细菌供体DNA转移到受体，使受体发生遗传变异的过程。,杂交结果,Strain LA-2：,Strain LA-22：,10-5 Prototrophs,phe+ trp+ met + his+,Davis U-tube实验,将两个亲本分别放在U形管两臂中，结果同样能获得原养型重组菌！而且只在LA-22中！,加压或吸压,菌株LA-22,菌株LA-2,涂布在固体平板的基本培养基上,微孔滤片,涂布在固体平板的基本培养基上

39、,没有菌落,原养型菌落（phe+ trp+ met + his+）,频率为10-5,根据以上结果推断，一种可以通过细菌滤片的因子将遗传信息从LA-2传递给了LA-22。称之为过滤因子（FA ）。 另一些实验又证明了： FA不是裸露的DNA，加入DNA酶并不能减弱FA的效力（同时也排除了转化）； LA-2产生FA需要LA-22的存在，FA能穿过微孔滤片； FA与从溶源性细菌中分离得到的温和噬菌体P22的质量大小相同； 用抗P22的血清或加热处理，P22的感染性和FA功能失活的速率相同； 抗噬菌体P22的在鼠伤寒沙门氏菌对FA也表现为抗性。 这些结果证明，FA就是温和噬菌体P22。,推论,LA-2

40、2菌株是溶源性的，LA-2是非溶源性的。在培养过程中，LA-22中的原噬菌体P22偶然裂解，穿过滤片后感染并裂解LA-2，包装了LA-2的基因，返回滤片感染LA-22并溶源化。给LA-22带入phe+ trp+ 。形成原养型菌落。,穿过滤片,原养型,LA-22 (+ P22),P22,偶然 溶菌,P22,感染LA-22,LA-22 重组,感染LA-2,偶然包装LA-2基因,P22,P22,2.普遍性转导(generalized transduction),例如：鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体、大肠杆菌的P1噬菌体,普遍性转导：供体细菌染色体DNA的任何基因或任何片段都有可能被噬菌体转入受体菌的过

41、程 。,通常能够进行普遍性转导的噬菌体是烈性噬菌体，他们感染细菌细胞后，在细胞内复制，最后导致细胞裂解。在裂解过程中，供体细胞DNA降解。噬菌体包装时可能以很低的频率发生错误而将供体细胞DNA误为噬菌体自身DNA进行包装。当这个噬菌体（转导噬菌体或转导颗粒）感染另一个细胞（受体）时，能够将供体DNA转移到受体细胞中，形成部分二倍体，并经过同源区段交换整合到受体细菌染色体DNA中，形成一个稳定的转导子。,1)由于噬菌体错误包装及注入受体菌的供体DNA片段是随机的，因而对所转导的基因没有限制。,2)转入受体菌的供体DNA片段在受体菌中不能复制，但可以通过DNA重组整合到受体染色体基因组，与受体菌染

42、色体一起复制 。,特点：,普遍性转导作图,利用普遍性转导，确定细菌基因之间的排列顺序和距离，构建它的遗传图。这种基因定位方法称为转导作图。,两个或两个以上基因同时被转导的现象称为共转导(cotransduction)或称为并发转导。共转导的频率愈高，表明两个基因在染色体上的距离愈近；反之则距离愈远。通过计算和比较两个基因之间的共转导频率，我们就可以确定三个或三个以上基因在染色体上的排列顺序以及他们之间的距离。,例如a 、b基因间的共转导频率很高，a、c基因的共转导频率也很高，而b 和c间很少或完全不在一起转导，那么这三个基因的顺序就应为bac。两个标记基因之间的距离可用下式计算： 其中d：两个

43、标记基因间的距离； X：两个基因的共转导频率； L：转导DNA的最大长度（相当于噬 菌体染色体长度，取2min）。,该作图方法类似于真核生物的两点测验。此外转导作图也可采用类似于三点测验的方法，即采用一次三因子转导(three-factor transduction)试验，就可推出三个基因的排列次序。 例如利用普遍性转导噬菌体P1，侵染基因型为ilv+ leu+ ara+的大肠杆菌，收集所得到的噬菌体裂解液再去侵染基因型为ilv- leu- ara-的受体菌，然后把受体菌接种在选择培养基上，选择标记基因为ilv+(在该培养基上只有ilv+转导才能生长)。然后用影印法测定其余两个非选择标记基因以

44、及他们的菌落数，得到如图的结果。,根据图中的结果，我们可以计算基因之间的共转导频率。 计算结果如下： ilv-leu 的共转导频率=（ilv+leu+ ara+）+（ilv+leu+ ara-）/总转 导子数= 1229+144/1229+144+72+1=94.84% ilv-ara 的共转导频率=（ilv+leu+ ara+）+（ilv+leu- ara+）/总转 导子数= 144+1/1229+144+72+1=9.97% leu-ara 的共转导频率=（ilv+leu+ ara+）/总转导子数 = 144/1229+144+72+1=9.9%,P1 噬菌体的染色体长度约为大肠杆菌染色体

45、长度的2%，相当于大肠杆菌遗传图谱的2分钟的大小。因此，PI噬菌体可以转导的最大长度相当于大肠杆菌遗传图谱2分钟。 通过共转导频率，我们可以计算基因间的距离。 ilv-ara 距离为：d=L（1-X1/3）=2（1-0.09971/3） =1.08 分钟 ilv-leu距离为：d=L（1-X1/3）=2（1-0.94841/3） =0.035 分钟,2.特异性转导（Specialized transduction）,这类噬菌体只能转导供体基因组中的特定基因，又称局限性转导。能进行局限性转导的噬菌体一般是温和噬菌体。 多数温和噬菌体在形成原噬菌体时，往往整合在细菌染色体上的特定的位置。原噬菌体离

46、开细菌染色体，一般可以精确切离形成一个完整的DNA，但偶尔发生偏差而形成带有gal或bio基因的转导噬菌体，同时将噬菌体部分DNA留在细菌染色体上。,噬菌体转导细菌基因gal的图解,小 结 病毒和细菌的遗传分析对建立和发展分子遗传学及遗传工程具有重要的意义。噬菌体的遗传分析主要是通过噬菌斑形态、寄主范围变异进行分析。细菌是通过分析其拟有性生殖过程来进行遗传分析。转化是通过细胞膜摄取供体DNA片断，转导是利用噬菌体为媒介细菌间遗传物质的转移，接合和性导都是利用性因子，细菌细胞接触后遗传物质从供体向受体转移。通过U型管试验、DNA酶处理、抗噬菌体血清处理等将各种拟有性生殖区分开来。利用拟有性生殖过程中形成的部分二倍体发生交换重组进行细菌基因的定位，也可利用中断杂交以时间为标准进行染色体作图。,