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1、第三章 菌种选育与培养,第一节 重要工业微生物的分离及菌种要求 第二节 工业微生物菌种的选育 第三节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏 第四节 种子的扩大培养,第一节 重要工业微生物的分离及菌种要求,微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。 有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。,一、工业生产常用的微生物,细
2、菌（bacteria） 酵母菌（yeast） 霉菌（mould） 放线菌（actinomycetes） 担子菌（basidiomycetes） 藻类（algae）,枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等， 用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等,单细胞真核生物，常用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等， 用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等,根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等,能产生多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等,通常所说菇类（mushroo
3、m）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发,用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻； 可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能,二、微生物工业对菌种的要求,原料廉价、生产迅速、目的产物产量高。 易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。 抗杂菌和噬菌体的能力强。 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。,目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求：,三、重要工业微生物的分离,分离 是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选
4、具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。,有时可以设计出一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法；也可用特定的分离方法先进行分离，随后再去识别所需的生产菌株。,定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,工业微生物分
5、离的程序：,A 采样对象,以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,1、采样,从自然界筛选,以温度适中，雨量不多的秋初为好。 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,B 采样季节,C采样方式,2、增殖培养,为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上
6、不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,（1）施加选择压力的分离方法,富集液体培养 富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。,3、培养分离,固体培养基的使用 该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的作用底物。,抗生素产生菌的筛选 抗生素可
7、作为分离步骤中的选择压力,（2）随机分离方法,生长因子产生菌的筛选 生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出产生菌。,多糖产生菌的筛选 可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,4、筛选,采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得到适合于工业生产用菌种。,5、毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将
8、其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,第二节 工业微生物菌种的选育,用发酵法生产产品，首先要有一个良好的菌种，因此必须进行菌种选育工作 菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展 通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍 菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和产生菌的遗传学研究等方面也发挥了重大作用 菌种选育的目的是改良菌种的特性，使
9、其符合工业生产的要求,一、自然选育,在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。 引起自发突变的原因：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应。 自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。,自然选育的方法与第一节介绍的微生物的分离方法相近，不同之处在于分离和筛选是同步进行的。,宇宙空间的各种短波辐射、自然界普遍存在的一些低浓度诱变物质、微生物自身代谢活动中产生的诱变物质。,四种碱基的酮基（酮式或烯醇式）和氨基（氨基式或亚氨基式）的互变异构。,1. 从自然界分离获得菌株,一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离
10、和性能测定等。,2. 从自发突变体中获得菌株,变异是育种的基础。 自然突变是指自然条件下出现的基因变化。 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株诱变育种。,二、诱变选育,使用诱变剂进行人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。 诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。 诱变育种的主要环节：,以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬
11、浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高； 用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。,出发菌株的选择,工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parent strain）。 一般有三种：,从自然界分离得到的野生型菌株； 通过生产选育，已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变可能性较大； 已经诱变过的菌株，负突变可能性较大。,菌悬液的制备,前培养,诱变,变异菌株的分离和筛选,1、诱变选育的程序,2、诱变育种方案设计,诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。,这些环节
12、是相互联系，缺一不可的。,（1）出发菌株的选择,选择单倍体纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。 不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。 选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。,（2）诱变剂的种类和选择,A、诱变剂,各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、射线、射线、射线和超声波等,直接与DNA发生化学反应：甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、氮芥、亚硝酸等 碱基类似物：5-溴尿嘧啶（BU）是胸腺嘧啶的类似物 引起移码突变：吖啶类染料,要根据诱变剂作用机制，结
13、合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂 ，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。 对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理； 对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。,嘧啶的 5位上溴原子代替甲基后可较多地出现烯醇式的嘧啶。 酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T碱基对变为A:BU，在下一次DNA复制中烯醇式的BU*和鸟嘌呤G配对而出现G:BU碱基对，最后在
14、又一次复制中G和C配对而终于出现G:C碱基对，完成了碱基的置换。,合适的剂量：能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量。 剂量的选择和诱变因素的使用随菌种的不同而异，因此需从工作中总结、摸索来确定。,诱变处理剂量的选择是一个比较复杂的问题，一般正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多出现于偏高剂量中。 对于经过多次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。 因此，目前处理剂量已从以前采用的死亡率9099减低为7080。,各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间,B、影响诱变效果的因素,出发菌株的遗传特性； 诱变剂； 菌种的生理状态； 被处理菌株的预培养条件； 诱变处理时的外界条件等。
15、,微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、融合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子,细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率；对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。,诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养2060min，再进行诱变处理，则
16、变异率可大幅度提高。,（3）突变的诱发,A、诱变剂接触DNA分子 B、DNA损伤的修复 C、从前突变到突变 D、从突变到突变型,光复活作用 切补修复 重组修复 SOS修复系统 DNA多聚酶的校正作用,（表型延迟：诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上，只有当经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落。）,（4）筛选的方法,A、营养缺陷型(auxotroph)的筛选方法,营养缺陷型菌株的工业应用价值：在直链式合成途径中，营养缺陷型突变株可积累中间产物；分支代谢途径中，可通过解除协同反馈调节而使另一分支末端产物积累。,与
17、营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ; 原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地
18、加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,筛选方法,一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。,淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。,（1）抗生素法： 细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。 酵母菌和霉菌用制霉
19、素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。,CM或SM培养基培养过夜，克服表型延迟,（2）菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔34h过滤一次，重复34次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。 （3）差别杀菌法 利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基
20、本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。,营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。,二,B、 抗性突变株的筛选,包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性突变株筛选，这些突变型常用来提高某些代谢产物的产量。筛选常用梯度平板法（gradient plate）。,抗药性突变株的应用： 作为菌株的遗传标记 作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）,（5）突变基因的表型,菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件。 突变株的遗传特性
21、改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。 在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件，以鉴别带有新特点的突变株，使高产基因能在生产规模下得以表达。,三、常规的杂交育种,遗传标记 异核体形成 杂合二倍体的形成 染色体交换和单倍体,四、原生质体融合,1. 标记菌株的筛选,供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。 采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。 通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。,2. 原生质体的制备,在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶（细菌或放线菌可用溶菌酶或青
22、霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。,影响原生质体制备的因素：,菌体的预处理 菌体的培养时间 酶浓度 酶解温度 酶解时间 渗透压稳定剂,用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。,一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。,一般控制在2040。,充足的酶解时间,对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和NaCl等。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。,3. 原生质体的融合和再生,
23、融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。 原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。,影响原生质体融合的因素： 菌体的前处理； 菌体的培养时间； 融合剂的浓度； 融合剂作用的时间； 阳离子的浓度； 融合的温度； 融合体系的pH值等。,影响原生质体再生的因素： 菌种自身的再生性能； 原生质体制备的条件； 再生培养基成分； 再生培养条件等。,将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数A； 将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：,用无菌水适当稀释，在完
24、全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数B； 用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和C。,4. 融合子的选择,融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。 在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。 在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。,5. 灭活原生质体融合技术在育种中的应用,灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，经细胞
25、融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。,该方法可以不用遗传标记,五、DNA重组技术,体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。 它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。,（一）DNA重组过程,基因的分离 载体的选择 DNA分子的切割与连接 重组载体引入宿主细胞 重组体的选择和鉴定 外源基因的表达,微生物中各种形式基因重组的比较,（二）分子育种技术,分子育种是应用基因工程手段进行的。 近年来，工程菌已逐渐开始应用发酵生产中。,链霉菌
26、的抗生素生物合成基因克隆 利用基因工程技术生产新的抗生素 利用基因工程技术生产氨基酸,克隆抗生素生物合成基因的7个克隆策略,检测克隆到标准宿主中的个别基因产物 利用产生菌阻断突变株的互补作用 利用突变克隆技术 连锁的抗生素抗性基因的克隆 用人工合成的寡核苷酸探测基因文库 直接克隆抗生素产生菌DNA大片断到非产生菌中 用一种抗生素的克隆DNA去探测相关抗生素的同源基因,第三节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏,一、微生物菌种的衰退,菌种的退化是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株退化的一个从量变到质变的遗传变异过程。 菌种的退化会使微生物个体和群体特征发生变化，其中最重要的使所需产物的生产
27、产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱。, 菌种连续传代导致自发突变或回复突变是菌种发生退化的直接原因。,由于连续传代使培养物经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是不断变化的，与处于休眠状态的培养物相比，细胞的自发突变率要高的多。菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。 培养基灭菌升、降温的不同，培养基存放时间的不同，采用老龄菌和多核菌丝等都比较容易引起菌种退化。,1. 菌种衰退的原因, 菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。, 菌种保藏方法不当。,各种
28、菌种的保藏法对阻止菌种变异的效果不尽相同，用效果较差的条件保藏菌种时，菌种就较易发生退化。 保藏操作不当也会影响保藏效果，会影响到菌种的变异。,2. 防止菌种衰退的措施,一、微生物菌种的衰退,（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法,尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。,如：在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果。,对于放线菌和霉菌，菌丝细胞常含有几个细胞核，因此用菌丝接种就易出现
29、衰退，而孢子一般是单核的，用于接种就可避免这种现象。,二、菌种的复壮,纯种分离 通过寄主体进行复壮 淘汰已衰退的个体,狭义的复壮仅是一种消极的措施，指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施； 广义的复壮是一项积极的措施，指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。,如:对S.microflavus”5406”农用抗生菌的分生孢子采用-1030的低温处理5-7天,使其死亡率达到80%左右,结果会在抗低温的存活个体中留
30、下未退化的个体,从而达到了复壮的效果。,三、菌种的保藏,一个优良的菌种被选育出来以后，要保持其生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡，这就需要对菌株进行保藏。尽量减少传代次数，防止菌种衰退。,1. 菌种保藏的原理,菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。 保藏时，一般利用菌种的繁殖体和休眠体（孢子、芽胞等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方法。 由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情
31、况而定。,2. 菌种保藏方法,*用斜面或半固体穿刺培养物均可，一般置于4下。 *对于可利用石油作碳源的微生物不适宜。,3. 菌种保藏的注意事项,菌种在保藏前所处的状态 菌种保藏所用的基质 操作过程对细胞结构的损害,4. 主要的菌种保藏机构, 从事原始菌株的保藏，进行有关保藏的研究； 提供保藏菌种的品种目录，定期（或不定期）出刊沟通信息； 提供菌种，促进微生物菌种的交流。,作用：,国内,1979年7月，我国在国家科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作会议，在会上成立了中国微生物菌种保藏管理委员会（China Committee for Culture Collection of M
32、icroorganisms，CCCCM），下设六个菌种保藏管理中心：,1、普通微生物菌种保藏管理中心,真菌、细菌,病毒,中国科学院微生物研究所（北京）,中国科学院武汉病毒研究所（武汉）,2、农业微生物菌种保藏管理中心,中国农业科学院土壤肥料研究所（北京）,3、工业微生物菌种保藏管理中心,轻工业部食品发酵工业科学研究所（北京）,4、医学微生物菌种保藏管理中心,真菌,中国医学科学院皮肤病研究所（南京）,细菌,卫生部药品生物制品检定所（北京）,病毒,中国医学科学院病毒研究所（北京）,5、抗生素菌种保藏管理中心,中国医学科学院抗生素研究所（北京）,四川抗生素工业研究所（成都）,华北药厂抗生素研究所（石
33、家庄）,新抗生素菌种,生产用抗生素菌种,6、兽医微生物菌种保藏管理中心,农业部兽医药品监察所研究所（北京）,国外,1、美国典型菌种收藏所 American Type Culture Collection（ATCC） 美国，马里兰州，罗克维尔市,2、冷泉港研究室 Cold Spring Harbor Laboratory（CSH） 美国,3、国立卫生研究院 National Institutes of Health（NIH） 美国，马里兰州，贝塞斯达市,4、美国农业部北方开发利用研究部 Northern Utilization Research and Development Division,
34、 U.S. Department of Agriculture（NRRL） 美国，皮奥里亚市,5、国立标准菌种研究所 National Collection of Type Culture（NCTC） 英国，伦敦,6、日本大阪发酵研究所 Institutes for Fermentation （IFO） 日本，大阪,7、日本东京大学应用微生物研究所 Institutes of Applied Microbiology （IAM） 日本，东京,第四节 种子的扩大培养,菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。 种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是经过种子制备培养出具有高质
35、量的生产种子供发酵生产使用。 如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足够而且不被其他杂菌污染的生产菌种，是种子制备工艺的关键。,将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯种的过程。,生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体 体积扩大的生物学过程。,生长：,生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,繁殖：,生长是一个逐步发生的量变过程， 繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。,在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是
36、紧密联系又很难划分的过程。,一、微生物生长现象,一个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加,如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,个体生长 个体繁殖 群体生长,在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）,微生物生长:,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与 研究大生物时有所不同。,微生物生长的测定：,个体计数 群体重量测定 群体生理指标测定
37、,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,二、微生物生长的测定,（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定,通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况 或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）,1、培养平板计数法,采用培养平板计数法要求操作熟练 、准确，否则难以得到正确的结果,样品充分混匀；,每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液；,同一稀释度三个以上重复,取平均值；,每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数；,一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（co
38、lony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。,2、膜过滤培养法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形 成的菌落进行统计。,3、The most probable number method（液体稀释法）,主要适用于只能进行液体培养的微生 物，或采用液体鉴别培养基进行直接 鉴定并计数的微生物。,对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。,
39、4、显微镜直接计数法,1）常规方法：,采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。,缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,4、显微镜直接计数法,2）其它方法：,将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀 后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。,比例计数：,过滤计数：,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显 微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数
40、；,活菌计数：,采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数,（二）以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法,在一定波长（一般450-650nm）下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.) 表示菌量。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。,2、重量法,以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量； 通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算 微生物群体的生物量；,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,3、 生理指标法,.微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。 样品中微生物数量多或生长旺盛
41、，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,微生物的特点：,个体微小,肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个 单个的微生物组成的群体。,微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。,三、微生物的群体生长,微生物群体生长可用生长曲线来表示,生长曲线(Growth Curve)：,定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。 对于单细胞微生物（如细菌和酵母），以培养时间为横坐标，细胞数目的对数值为纵坐标，可绘制出一条由延滞期、指数期、稳定期和衰亡期4个阶段组成的典型生长曲线。,在微生物学中提到的“生长”
42、，均指群体生长。,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,一条典型的生长曲线至少可以分为 延滞期，指数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期,延滞期(Lag phase)：,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加， 或增加很少，生长速度接近于零。也称停滞期、调整期或适应期。,延滞期的特点：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在延滞期末期，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、 酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。,细胞处于活跃生长中，
43、只是分裂迟缓 在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上 升。,延滞期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。,调整代谢,延滞期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境 条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。,在生产实践中缩短延滞期的常用手段：,(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；,(2)利用对数生长期的细胞作为种子；,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(4)适当扩大接种量,指数生长期(Exponential phase)：,又称对
44、数生长期(Log phase) 以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。 对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的延滞期缩短，提高经济效益。,t1 t0 0.639 G = = n m m：比生长速率,在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time)，通常以G表示，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time)。,纳米细菌（nanobacteria），
45、三天才分裂一次； 二十世纪九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。,影响微生物增代时间（代时）的因素：,1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短,3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物成分，就称为生长限制因子。,4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,稳定生长期(Stationary phase)：,由于营养物质消耗，代谢产物积累
46、和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。,稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数 最高并维持稳定。,细胞重要的分化调节阶段； 储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。,生产上为获得更多的菌体或代谢产物 1. 补充营养物质或取走代谢产物 2. 调节pH、温度 3. 对好氧菌增加通气 4. 搅拌或振荡等措施延长稳定生长期,衰亡期(Decline或Death phase)：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速
47、率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。 该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。,细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。,由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到 准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测 定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。,菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延缓期短； 生理性状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发
48、酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力,种子的要求,四、工业微生物的扩大培养,、种子扩大培养的任务,得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。,对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。,抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用三级种子扩大培养； 一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产； 有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵； 谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种生产繁殖速度很快，常采用二级发酵。,、种子制备的过程,种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的制备过程和在液体培养基中生产大量菌
49、丝或营养体的种子制备过程。,（1） 孢子制备（实验室种子制备）,孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。 不同菌种的孢子制备工艺有不同的特点。,放线菌孢子的制备 霉菌孢子的制备 细菌培养物的制备,放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1，氮源不超过0.5），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。 放线菌斜面的培养温度大多数为28，少数为37，培养时间为514天。,1）放线菌孢子的制备,采用母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异； 采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。,菌种接入种子罐有两种方法：,孢子进罐法将斜面孢子制成孢子悬浮法直接接入种子罐，可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点； 摇瓶菌丝进罐法适用于某些生长发育缓慢的放线菌，可以缩短种子在种子罐内的培养时间。,2）霉菌孢子的制备 3）细菌培养物的制备,霉菌的孢子培养，一般以大米、