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1、绍兴文理学院元培学院生命科学系,第三章 核酸化学,Nucleic Acids,第一节 核酸概述 第二节 核酸的分子组成 第三节 核酸的分子结构 第四节 核酸的理化性质 第五节 核酸酶(nucleases),第一节 概 述,核酸(nucleic acid) 以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。 DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid) 核糖核酸,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的
2、双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,一、核酸的发现和研究工作进展,二、核酸的分类及分布、功能,(deoxyribonucleic acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。
3、,分布于胞核、胞液。,携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。,参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,第二节 核酸的分子组成P223,一、元素组成,主要元素组成： C、H、O、N、P(911%),与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,二、基本构成单位：核苷酸(nucleotide),核苷酸由戊糖、磷酸和碱基三部分构成,戊 糖,D-核糖(D-ribose) D-2-脱氧核糖(D-2-deoxyribose ),碱 基,表 1 两类核酸的基本化学组成,核苷 nucleoside,糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键
4、。,核糖核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名,核苷和磷酸以磷酸酯键连接,核苷酸的代号 一般以核苷号加“MP”形成 ，如5AMP。常见核苷酸多为5核苷酸，通常不写出酯化位置（5略去）。如5 AMP写成AMP。,3,5-磷酸二酯键,细胞内的其他核苷酸及核苷酸衍生物,多磷酸核苷酸 ADP、ATP、GDP、GTP等。 ATP的重要生理功能： 参与能量代谢。 各种三磷酸核苷酸参与DNA 、RAN的生物合成（作原料）； 参与其它合成。如UTP参加糖转化、合成，CTP参与嘌呤、蛋白质的合成； 作辅酶的结构成分。
5、如NAD、 NADP。,胞内,ATP cAMP + PPi,磷酸二酯酶,5-AMP,腺苷酸环化酶 （AC）,稀有核苷酸,修饰成分,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,第三节 核酸的分子结构,一、一级结构（primary structure）P227,一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。,1、核苷酸的连接方式： 3, 5磷酸二酯键,2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链,末端： 5 端、 3端 多核苷酸链的方向： 5端3端(由左至右),3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写,二、DNA的空间结构P230,
6、（一）DNA的二级结构（secondary structure）,1、碱基组成规则(Chargaff规则),A=T，G=C； A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等),有种属特异性,无组织、器官特异性,不受年龄、营养、性别及其他环境等影响,生物体DNA是由两条走向相反的双链互相盘绕而成的右旋螺旋式结构,这种双螺旋结构就是DAN的二级结构,DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA双螺旋结构的特点,double helix model,DNA双螺旋结构的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组
7、成;右手双螺旋结构;两条链方向相反，5端3端;3端5端。,（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。,（3）螺旋横截面的直径约2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩为3.4 nm。,（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。 A=T，GC A+G=T+C,（5）螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。 （6）氢键维持
8、双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础,（5）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定,2、其他螺旋形式,Z-DNA（左手双螺旋） A-DNA,2、其他螺旋形式,Z-DNA（左手双螺旋） A-DNA,DNA双螺旋的稳定性,DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。 维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键，碱基堆积力。 双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响； 介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等
9、。 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,天然存在的DNA分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在1061010。 大肠杆菌染色体由400万碱基对(basepair，bp)组成的双螺旋DNA单分子。其长度为1.4106nm，相当于1.4mm，而直径为20nm，相当原子的大小。 黑腹果蝇最大染色体由6.2107bp组成，长2.1cm 多瘤病毒的DNA由5100bp组成 ，长1.7mm,1 、双螺旋DNA分子在二级结构基础上进一步扭曲 折叠形成的特定构象。 2 、环形双链DNA分子可以进一步扭曲成超螺旋结 构，首尾可共价连接成环状，分为负超螺旋、正超 螺旋。,（二）DNA的三级结构-
10、超螺旋结构 P234,当将处于松弛状态的双螺旋向左捻动时（即沿右手螺旋相反方向捻动），等于解旋（所谓的“卸劲”）。处于这样状态的DNA分子相对于它的松弛状态是一种没有达到原有旋转状态的状态，所以称之欠旋。反之称为过旋。由于DNA分子的两端被固定，过旋和欠旋都会给双螺旋DNA分子增加了额外的应力。,当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋（supercoils）来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持构象。过旋DNA会自动形成额外左手螺旋，这样的超螺旋称之正超螺旋（positive supercoils）；而欠旋形成额外右手螺旋，称之负超螺旋（negative s
11、upercoils）。,按照细胞的结构和遗传物质在细胞内的分布，生命有机体可大致划分为：原核生物（ Prokaryotes ） 真核生物（ Eukaryotes ）, 原核生物（ Prokaryotes ）,遗传物质类核或拟核 习惯上也称为染色体,类核或拟核,DNA在真核生物细胞核内的组装（视频）P236, 真核生物（ Eukaryotes ）,遗传物质集中存在于核膜包围的细胞核中,并与特殊的蛋白质结合为核蛋白 染色体,真核细胞和原核细胞的区别：,真核细胞染色体的组成,1、蛋白质 染色体蛋白主要分为 组蛋白和非组蛋白两类。 真核细胞的染色体中，DNA与组蛋白的质量比约为1：1。DNA、组蛋白和
12、非组蛋白及部分RNA（尚未完成转录而仍与模板DNA相连接的那些RNA，其含量不到DNA的10%）组成了染色体。,组蛋白是染色体的结构蛋白，分为H1、H2A、H2B、H3及H4五种，与DNA共同组成核小体。,2、核小体（Nuclearsome）,染色体结构的第一个层次，构成染色质的基本结构单位, 146bpDNA 组蛋白 八聚体核小体的核心颗粒 直径约10nm,（1）、核小体的组成,146bp的核心DNA在组蛋白八聚体上盘绕1.8圈,Mononucleosomes typically have 200 bp DNA. End-trimming reduces the length of DNA
13、first to 165 bp, and then generates core particles with 146 bp., 微球菌酶处理所得核小体DNA长度的变化,Chromatosome 166 bp, 2 superhelical turn,* 组蛋白H1把核小体 “封锁”起来,其中，166bp核小体DAN的堆积比为10 56nm线性长度5.6nm螺线管,连接 DNA 100 bp 平均 55 bp,Nucleosome,Histone H1,Nucleosome repeat: Core + linker DNA 200 bp,2、染色体结构的形成,（1） 首先若干个核小体形成念珠
14、状结构,The 10 nm fiber is a continuous strong of nucleosomes.,每个核小体单位包括：200bp左右的DNA、一个组蛋白八聚体、一分子H1,高度有序 左手螺旋 每圈包括六个核小体,30 nm fiber (直径30nm) Solenoid (螺线管）,（2） 30nm纤丝的构成 染色质结构的第二层次,a、组成,30 nm fiber,300 nm,b、体内存在状态,从DNA到染色体的过程,Compaction ratio = 8000,三、RNA的结构特点,RNA是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。 RNA分子中，
15、部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。 在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。 tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分。,mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,真核细胞,内含子 (intron),外显子 (exon),* 真核生物mRNA成熟过程（视频）：,（一）mRNA的结构特征 mRN
16、A一般呈单链，分子大小不一。可以自身回折成一般RNA的二级结构，如发夹式。 真核生物细胞中mRNA的特征结构P229 1、5帽子结构：7甲基鸟苷（m7G ）以55焦磷酸键连接于mRNA的5端；邻近的核糖2OH同时CH3 化形成帽子。,5-cap的功能,(1) 防止mRNA被核酸酶降解。可以保护mRNA5端不被5核糖核酸酶等水解，从而提高mRNA的稳定性。,(2) 有助于核糖体对mRNA的识别和结合，使翻译得以正确开始。,2、3-PolyA尾：在3端有一段约20200个腺苷酸组成的多聚腺苷酸。P229,polyA的功能 ：,(1) 保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。,(2) 与翻译有关，没有p
17、olyA翻译活性降低。,(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。,（二）tRNA的结构与功能,* tRNA的一级结构特点 含 1020% 稀有碱基，如 DHU、 、I 3末端为 - CCA-OH 5末端大多数为鸟嘧啶G或C 具有 TC 环,双氢尿嘧啶(DHU),假尿嘧啶(),次黄嘌呤(I),* tRNA的二级结构 三叶草形P239 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与mRNA的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗传密码，称为反密码子（anticodon）。,* tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,二氢
18、尿嘧啶环（DHU）：识别氨酰-tRNA合成酶,TC环：识别核蛋白体(核糖体),氨基酸臂：3末端的CCA-OH用于连接氨基酸。,三级结构: “倒L”型,维持tRNA的作用力 ： （）氢键和碱基的上下堆积，以及疏水性等使得倒“L”结构稳定存在。 （）除了碱基对的氢键外，还有非寻常的氢键：不互补的碱基间GG、AA、AC等的氢键；核糖磷酸骨架与碱基骨架之间的氢键。,存在于核糖体中，占其重量的2/3，与蛋白质结合。 单链，有螺旋区，发夹形结构，构象不稳定。 核糖体由大小两个亚基组成，均含有rRNA。 原核生物:30S（16srRNA）、50S（5s、23srRNA）； 真核生物:40S（18srRNA）
19、、60S（5s、5.8s、28srRNA） 主要功能：是形成核糖体，作为蛋白质合成的场所。,（三）rRNA的结构与功能,大肠杆菌E.Coli 16srRNA的结构,核糖体上蛋白质合成过程中mRNA、tRNA 的作用，及肽链的延伸示意图。,mRNA,tRNA,核糖体,（四）其他小分子RNA及RNA组学,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。,种类：核内小RNA；核仁小RNA；胞质小RNA；催化性小R
20、NA；小片段干涉 RNA,功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。,第四节 核酸的理化性质,一、一般性质,（一）两性性质P245 由于核酸、核苷酸中含有碱基和磷酸基，而呈两性电 离，是两性电解质。磷酸基比碱基更易解离，故核酸表现 为酸性。 （二） 核酸的水解 1、碱水解：室温，稀碱下，RNA可水解为核苷酸； DNA不能水解。 2、酸水解：稀酸长时间或高温或强酸处理核酸，可促 使核酸发生糖苷键、二酯键水解。 3、酶水解：核酸酶、核苷酸酶等。,（三） 沉降特性 P25
21、3 由于溶液中的核酸在离心场中可下沉，因而可用超离心法纯化核酸，沉降速度有差异：RNA环形DNA线形DANPRO或将不同构象的核酸分离，也可测沉降系数和分子量。,二、核酸的紫外吸收性质P249,最大吸收峰在260nm,判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,三、核酸的变性与复性 P250,（一）核酸的变性 1、核酸的变性的概念 指核酸的双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂，分子量不变，一级结构不发生变化。 2、变性因素：加热、酸碱度改变、有机溶剂、酰胺、尿素等。 3、变性表现：双螺旋解体，形成无规则线
22、团，粘度下降，浮力密度升高；部分或全部失去生物活性；OD260增高。,DNA分子的变性,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,4、解链温度Tm 通常把DNA的变性达到50%，即增色效应达到一半时的温度称为该DNA的“熔点”或“解链温度” ，以Tm表示，或以T1/2表示，意为DNA失去一半双螺旋时的温度。 核酸分子中一般以GC碱基对较AT碱基对稳定，故富含GC碱基对的DNA的Tm值相对高，因此测定Tm值可以粗略推算碱基对的含量。,影响Tm值的因素,(1)溶液的性质,(2)DNA的性质和组成,大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线,（二）DNA的复性,DNA复性(rena
23、turation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,减色效应（hypochromic effect ）:DNA复性时，其溶液OD260降低。,1、热变性的DNA骤然冷却不可能复性，缓慢冷却时可复性。 2、DNA大小：DNA片段越大，复性越慢。 3、DNA浓度：DNA浓度越大，复性越快。 4、离子强度：增加盐浓度，两条互补链重新结合的速度加快。,复性表现：许多理化性质可恢复，生物活性得以部分恢复。但是条件较复杂：,(三) 核酸的杂交(hybridization)
24、热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。 这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,第五节 核酸酶(nucleases),核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,一、种类,1、根据底物分类 DNase、RNase； 单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶,2、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶 外切酶：5端3端或3端5端核酸外切酶。 内切酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。 限制性核酸内切酶(restriction endonucleases)：能够识别DNA分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开DNA双链的一类核酸酶,参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,二、核酸酶的功能,