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1、第三章 蛋白质化学,2,3.3 肽（peptides）,3.3.1 几个相关的概念,肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。组成肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,肽与氨基酸残基：,肽键(peptide bond): 是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的酰胺键。,3,由两个氨基酸残基组成的肽称为二肽(dipeptide)；由三个以上十个以下氨基酸残基组成的肽称为寡肽(oligopeptide)；由多个氨基酸组成的肽则称为多肽(polypeptide), 亦称多肽链。,二肽，寡肽与多肽：,注：肽链可以是链状、环状或分支状。,4,肽键的特点, 肽键的特点是氮原子
2、上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。 在细胞内环境条件下，肽键相对稳定,5,通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。,肽链书写方式：N端C端,肽链的N-端与C-端：,氨基酸顺序：,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序，氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。,6,上述五肽可简写表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,肽链的表示法(简写)及
3、命名,7,多肽与蛋白质,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。,蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。,蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,8,3.3.2 肽的理化性质,(1)两性解离与等电点,肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。,由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK
4、2。R基的pK变化不大。,肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值。,9,(2)肽的旋光性及紫外吸收 肽具有旋光性，短肽的旋光度等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度之和；长肽的旋光度比累加的和小很多。 肽在紫外吸收区215nm处有最大吸收峰，可以用来作为肽的定量测定。,10,（3）肽的化学性质,肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽有与氨基酸不同的特殊反应。,（a）双缩脲反应,（b）茚三酮反应 肽与茚三酮反应不放出CO2。,肽和蛋白质特有，用于肽和蛋白质的定量测定。,11,3.3.3 天然存在的某些活性肽,(1) 肌肽和鹅肌肽,肌肽（carnosine）:-Ala-His,鹅
5、肌肽（anserine）：-Ala-1-Me-His,12,(2) 谷胱甘肽(glutathione,GSH),13,GSH具有重要的功能：,1、解毒功能：与重金属离子、环氧化物（致癌物）结合排出体外。 2、维持红细胞膜的完整性。 3、参与高铁血红蛋白的还原作用。 4、促进铁的吸收。,14,(3) 多肽抗菌素,环 链 肽,15,(4) 多肽激素,种类较多，生理功能各异。 多肽类激素主要见于垂体及下丘脑分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。 神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等
6、。,16,垂体后叶激素如催产素和加压素,17,18,(5) 神经肽,甲硫氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Met,亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu,功能：镇痛,例如脑啡肽 (enkephalin)：,Responsible for signal transduction (信号转导) in neurotransmission 脑啡肽(enkephalin)；内啡肽(Endorphin)；强啡肽(dynorphin)； P物质 (Substance P)；神经肽Y (neuropeptide Y),19,3.4 蛋白质的分类,3 根据溶解度分类（清蛋白、球蛋白、谷蛋
7、白、醇溶蛋白、 精蛋白、组蛋白、硬蛋白）,20,简单蛋白质分类,只有- 氨基酸组成。,21,结合蛋白质分类,由单纯蛋白质与非蛋白质物质结合而成。,22,为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。,蛋白质的一级结构又称初级结构，二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象。,3.5 蛋白质的结构,23,构象与构型,24,3.5.1 蛋白质结构的近代概念,3.5 蛋白质的结构,25,一级结构(primary structure)：氨基酸序列，肽键相连. 高级结构 二级结构(secondary structu
8、re)：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构， -螺旋 、-折叠、-转角和无规卷曲 三级结构(tertiary structure):整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，主要靠次级键（疏水键、离子键、氢键和Van der Walls力维持） 四级结构(quaternary structure):蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用（主要靠疏水键维持）,26,3.5.2 蛋白质结构的研究方法,3.5.2.1 一级结构的研究方法 肽链水解与末端分析法,3.5.2.2 高级结构的研究方法 重氢交换法 核磁共振光谱法 园二色性 荧光偏振法 红外偏振法,27,3.5.3 蛋白
9、质的一级结构（primary structure）,蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的线性排列顺序（sequence）。,氨基酸顺序书写时，从 N-末端(N-terminus) 至 C-末端 (C-terminus).,肽键(peptide bond)和二硫键(disulfide bond) 均属于蛋白质一级结构.,28,1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。Sanger由此1958年获Nobel 化学奖。 1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。 蛋白质的一级结构由遗传信息决定，其一级结构决定
10、高级结构，一级结构是基本结构。但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。,29,Gly,Ile,Val,Cys,Glu,Gln,Ala,Ser,Phe,Lys,Val,Cys,Pro,Arg,Asp,Leu,Tyr,Thr,Asn,Lys,His,Leu,COO-,H3N+,S S,30,3.5.3.1 蛋白质一级结构的测定AA序列的测定,序列测定前的准备工作：,样品的纯度,相对分子质量,肽链的数目,氨基酸组成,一级结构的测定主要用小片段重叠法,原理：,31,（1）末端分析：包括N端分析，C端分析,N端分析方法, 二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）,序列测定步骤与方法,32,
11、 丹磺酰氯法（DNS法）,33, 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 ）,34, 氨肽酶（aminopeptidase, Apase）法,Ala,Val,Gly,35,亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase, LAP）,专一性:,A=非极性氨基酸时 快,A=其它氨基酸时 慢,A=Leu时 最快,36, 肼解法：也称联氨法,C端分析,苯甲醛缩合,二亚苄衍生物 (不溶于水),溶于水,37,C端分析, 硼氢化锂还原法,38, 羧肽酶（carboxypeptidase, Cpase）法,39,4种羧肽酶的来源和专一性,40,（2）肽链的拆开和分离
12、与纯化,共价键： 主要是二硫键折分,分离纯化：,采用还原法或氧化法,序列测定步骤与方法,Dialysis (透析) Acetone precipitation and salt precipitation (沉淀) Electrophoresis (电泳) Chromatography (层析) Ultracentrifugation (超离心),41,（3）肽链的氨基酸组成分析,酸水解：通常用6mol/L HCl,HPLC分析AA组成,序列测定步骤与方法,42,（4）肽链的部分水解,化学方法：,溴化氰（CNBr）裂解法:,序列测定步骤与方法,43,酶解方法,44,（5）肽段的分离和氨基酸序列
13、测定,Edman降解（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,序列测定步骤与方法,45,（6）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列,序列测定步骤与方法,46,（7）二硫键位置的确定,对角线电泳,47,4蛋白质序列数据库,(1) PIR（Protein Information Resource）数据库,(2) SWISS-PROT数据库,48,3.5.4 蛋白质的二级结构,指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象.,酰胺平面是构成主链构象的基本单位。,定义：,49,3.5.4.1肽键
14、平面(或称酰胺平面,amide plane),在肽链中每6个原子C-C(=O)-N(-H)-C构成一个肽单元; Pauling等人对一些简单的肽及氨基酸的酰胺等进行了X射线衍射分析，得出下图所示结构：,50,(1)肽键中的C-N键长0.132nm，比相邻的N-C单键(0.147nm)短，而较一般C=N双键(0.127nm)长，可见，肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间，具有部分双键的性质，因而不能旋转，这就将固定在一个平面之内。,酰胺平面的特性,51,(2)肽键的C及N周围三个键角之和均为360，说明都处于一个平面上，也就是说六个原子（-CCONHC-）基本上同处于一个平面，这就是肽键平面
15、(或酰胺平面).参与肽键的6个原子:-C-CO-NH-C- 称为肽单元(peptide unit)； (3)肽链中能够旋转的只有碳原子所形成的单键，此单键的旋转决定两个肽键平面的位置关系，于是肽键平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。 (4)肽键中的C-N既具有双键性质，就会有顺反不同的立体异构，已证实CO和NH处于反位。,52,C,C3,C2,C1,C,N,N,H,H,H,O,O,R,酰胺平面 1,酰胺平面 2,肽单元及其旋转,53,Trans and cis peptide bonds. The trans form is strongly favored because of steric c
16、lashes that occur in the cis form.,反式（Trans）,顺式（cis）,54,3.5.4.2 -螺旋(- helix),1950年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时，提出了-螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在-螺旋。,定义：蛋白质分子中局部肽链的肽平面通过碳原子旋转，使碳链主链沿中心轴盘曲成稳定的右手螺旋构象. 如： 角蛋白（皮肤、毛发、指甲、和角）,0.54 n m 3.6个残基,0.15 n m,55, 蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，螺旋上升时
17、，每个残基沿轴旋转100。 （=-57, =-47）；, 在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。, -螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。, -螺旋结构的要点如下：,左手和右手螺旋,(顺时针),(逆时针), R侧链位于螺旋外侧，其大小、形状及电荷等是影响此结构形成的主要因素。,56,The oxygen-carrying molecule myoglobin (153 amino acids long) is shown, with one region of helix outlined in color. A perfe
18、ct helix is shown in outline,57, -螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。,The -CO group of peptide unit n is H-bonded to the -NH group of peptide unit (n+4).,58,一些侧链基团虽然不参与螺旋，但他们可影响 -螺旋的稳定性,59,3.5.4.3 -折叠,也是pauling等人提出来的，它是与 - 螺旋完全不同的一种结构。, -折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。, 在两条相邻的肽链之间形成氢链。,60, -折叠有平行和反平行的两种形式:, 每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行
19、的是0.325nm，反平 行的是0.35nm。,61,N端,平行式,反平行式,N端,N端,C端,折叠靠不同肽键之间的肽键上CO与NH形成氢键而得 以稳定。反平行式比平行式稳定。,62,A protein rich in sheets. The structure of a fatty acid-binding protein.,63,3.5.4.4 -转角 (-turn),-转角是指蛋白质分子的多肽链经常出现180的回折，在回折角上的结构就称-转角，也称发夹结构，或称U形转折。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH之间形成氢键。,Gly and Pro residues often
20、 occur in -turn,- 转角在鸡蛋清溶菌酶中存在，多出现于蛋白质表面。,64,-转角 (-turn)有两种类型：型和型,区别：连接2位残基与3位残基的肽单位旋转了1800.,65,没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同分两类：,3.5.4.5 自由回转无规卷曲(random coil), 连接条带, 紧密环如环,环,66,-螺旋 (- helix),-折叠 (- pleated sheet),-转角(- turn),蛋白质空间结构单元,环(loop),无规则卷曲（random coil）
21、,Ribbon model of the bacterial catabolite gene activator protein (CAP),67,在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：；, ,3.5.5 超二级结构和结构域,（）超二级结构(supersecondary structure),超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域,68,两个聚集体连在一起形成 结构，称Rossmann折叠,Rossmann折叠,Rossmann折叠,它们可直接作为三级结构的“建筑块”或结构
22、域的组成单位，是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次，故称超二级结构。,69,（）结构域,结构域是 1970年Edelman提出的，它是指在较大的球状蛋白质分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域。,结构域(domain)也是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。一般每个结构域约由100-200个氨基酸残基组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。,70,结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白
23、质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。 结构域一般由100200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上 结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性,71,对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白
24、质分子可以由2个或更多个结构域组成。,72,结构域有时也称功能域，功能域是指有功能的部分,功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。,从动力学的角度来看，一条长的多肽链先折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构更合理。,从功能的角度来看，酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间，因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链，使结构域在空间上摆动比较自由，容易形成适合底物结合的空间。,73,3.5.6 三级结构,蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构(tertiary structure)。,肌红
25、蛋白的三级结构,74,(运) 铁蛋白的三级结构 (纯-螺旋),75,质体蓝素的三级结构（纯结构）,76,丙糖磷酸异构酶三级结构（、混合结构）,77,免疫球蛋白链三级结构,78,蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力(Van der Wasls力)等。这些次级键可存在于一级结构序号相隔很远的氨基酸残基的R基团之间，因此蛋白质的三级结构主要指氨基酸残基的侧链间的结合。 次级键都是非共价键，易受环境中pH、温度、离子强度等的影响，有变动的可能性。二硫键不属于次级键，但在某些肽链中能使远隔的二个肽段联系在一起，这对于蛋白质三级结构的稳定上起着重要作用。,79,具备三级结构
26、的蛋白质从其外形上看，有的细长(长轴比短轴大10倍以上)，属于纤维状蛋白质(fibrous protein)，如丝心蛋白；有的长短轴相差不多基本上呈球形，属于球状蛋白质(globular protein)，如血浆清蛋白、球蛋白、肌红蛋白，球状蛋白的疏水基多聚集在分子的内部，而亲水基则多分布在分子表面，因而球状蛋白质是亲水的，更重要的是，多肽链经过如此盘曲后，可形成某些发挥生物学功能的特定区域，例如酶的活性中心等。,80,1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x-射线衍射分析，测得了它的空间结构。,例子,81,3.5.7 蛋白质的四级结构,四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位
27、的布局。亚基之间不含共价键，亚基间次级键的结合比二、三级结构疏松，因此在一定的条件下，四级结构的蛋白质可分离为其组成的亚基，而亚基本身构象仍可不变.,具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构称为蛋白质的四级结构(quarternary structure)。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基(subunit)。,82,一种蛋白质中，亚基结构可以相同，也可不同。如烟草斑纹病毒的外壳蛋白是由2200个相同的亚基形成的多聚体；正常血红蛋白是两个亚基与两个亚基形成的四聚体；天冬氨酸氨甲酰基转移酶由六个调节亚基与六个催化亚基组成。 有人
28、将具有全套不同亚基的最小单位称为原聚体(protomer)，如一个催化亚基与一个调节亚基结合成天冬氨酸氨甲酰基转移酶的原聚体。,83,某些蛋白质分子可进一步聚合成聚合体(polymer)。聚合体中的重复单位称为单体(monomer)，聚合体可按其中所含单体的数量不同而分为二聚体、三聚体寡聚体(oligomer)和多聚体(polymer)而存在，如胰岛素(insulin)在体内可形成二聚体及六聚体。,84,两个亚基的结构,85,Hemoglobin血红蛋白,Myoglobin肌红蛋白 由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白,Mathews et al (2000) Biochemistry (
29、3e) p.214,86,3.5.8 蛋白质分子中的重要化学键 蛋白质分子中的非共价键,H H O OH C N O H C N H,氢键：是非共价键中键能最弱，但数目最多最重要的键。,O H,O H,87,CH2-CH-CO-,NH-,CH2-CH-CO-,NH-,-NH-CH-CO- CH3 CH3 -NH-CH-CO,疏水键：蛋白质分子中疏水性较强的非极性基团为避开水相而聚集在一起的作用力。,盐键：即离子键，由一个肽链的羧基与另一个肽链的氨基相互结合而成。生理情况下，Asp 和 Lys 间可形成盐键 。,88,范德华力：是分子间由于静电吸引产生的吸引力。 酯键：羟基氨基酸的羟基与二羧酸的或 羧基相连而成。 此外, 二硫键（共价键）、配位键也是维持蛋白质空间结构的化学键 由于多肽链中的各氨基酸残基的性质和排列顺序不同, 天然 蛋白质可折叠、盘绕成一定的空间结构。,89,NH3+,O O =C,S,S,CH CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH,N H O,氢键、疏水键、离子键（盐键）、二硫键和范德华力,盐键,疏水键,二硫键,氢键,疏水键,范德华力,CH3,CH3,90,维持三级结构的作用力,P121，思考题3,6,谢谢！,