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1、第四章 蛋白质,Chapter 4 Protein,教学目的,1.掌握氨基酸的结构、分类和理化性质 2.了解氨基酸的分离和分析方法 3.掌握蛋白质的元素组成、基本组成单位，肽链的连 接方式；熟悉氨基酸的通式与结构特点。 4.掌握蛋白质的分子结构；熟悉蛋白质结构与功能的关系。 5.掌握蛋白质的主要理化性质；熟悉蛋白质分离纯化方法的依据、基本原理。,本 章 内 容,第一节 概 述 第二节 氨基酸 第三节 蛋白质的结构 第四节 蛋白质的结构与功能的关系 第五节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 习 题 三,第一节 概 述,一、蛋白质的定义 蛋白质(protein)是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生
2、物大分子,并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此,研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。可以说没有蛋白质就没有生命。 蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子。其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。 二、蛋白质在生命中的重要性 生物体最主要的特征是生命活动,而蛋白质是生命活动的体现者: 酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂,代谢反应几乎都是在酶的催化下进行的。,结构蛋白参与细胞和组织的建成,如微管蛋白、伸展蛋白、胶原蛋白、膜蛋白、角蛋白等。 某些动物激素是蛋白质,如胰岛素、生长素、
3、促卵泡激素、促甲状腺激素等,在代谢调节中具有十分重要的作用。 运动蛋白如肌肉中的肌动蛋白、肌球蛋白(收缩蛋白)以及鞭毛和纤毛蛋白与肌肉收缩和细胞运动有关。 高等动物的抗体、补体、干扰素等蛋白质具有防御功能。 某些蛋白质具有运输功能,如血红蛋白和肌红蛋白运输氧;脂蛋白运输脂类;细胞色素和铁氧还蛋白传递电子;细胞膜上的离子通道、离子泵、载体等运输离子和代谢物。 激素和神经递质的受体蛋白有接受和传递信息的功能。细胞表面抗原参与免疫反应和细胞识别。 染色质蛋白、阻遏蛋白、转录因子等参与基因表达的调控;细胞周期蛋白等具有调控细胞分裂、增殖、生长、分化的功能。 种子贮藏蛋白、卵白蛋白、酪蛋白、血浆白蛋白等
4、具有贮存氨基酸和蛋白质的功能。 此外,如视网膜上感觉光信号的视色素,味蕾上的味觉蛋白,某些植物、昆虫、微生物产生的毒素蛋白,各有其独特的功能。,三、蛋白质的组成 1.元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量 各种蛋白质的氮含量都近于16，这是蛋白质元素组成的一个特点，此值在蛋白质的定量上很有用，先测出蛋白质样品的总氮量百分数，再乘以常数6.25。6.25即10016，为l克氮所代表的蛋白质重量(1克
5、氮=6.25克蛋白质)。 蛋白质的含量=蛋白氮6.25,蛋白质含量的测定： 凯氏定氮法 (测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单， 方法也简单； 缺点：易将无机氮(如核酸中的氮) 都归入蛋白质中，不精确。 除了上法外，还有 紫外比色法 双缩脲法 Folin酚 考马斯亮兰G250比色法 （条件：蛋白质必须是可溶的） 2. 化学组成（两种类型） 单纯蛋白质：水解为 -氨基酸 结合蛋白质=单纯蛋白质+辅基 有些蛋白质除了蛋白质部分外，还有非蛋白质成分，这种成分称辅基或配基，这类蛋白质称为结合蛋白质，如血红蛋白，核蛋白。,四. 蛋白质的分类 蛋白质的分类方法有如下三种： (一) 根据分子的
6、形状分类 可分为球状蛋白和纤维状蛋白。 1.球状蛋白 分子似球形，较易溶解，如血红蛋白、免疫球蛋白等。 2.纤维状蛋白 形如纤维。不溶于水，如指甲、羽毛中的角蛋白和蚕丝的丝蛋白等。 (二) 根据组成分类 可分为单纯蛋白质和结合蛋白质。 1.单纯蛋白质 其组分只有-氨基酸，不含其他物质。自然界的许多蛋白质都属于此类。 2.结合蛋白质 由单纯蛋白质与非蛋白物质结合而成。根据非蛋白部分(称为辅基)的不同可分下列几类:,蛋白质名称 辅 基 举 例 核蛋白 核 酸 染色体蛋白、病毒核蛋白 糖蛋白 糖 类 免疫球蛋白、粘蛋白 色蛋白 色 素 血红蛋白、黄素蛋白 脂蛋白 脂 类 -脂蛋白、-脂蛋白 磷蛋白
7、磷 酸 胃蛋白酶、酪蛋白 金属蛋白 金属离子 铁蛋门、超氧化物歧化酶 (三) 根据溶解度分类 1清蛋白类 清蛋白溶于水，如血清白蛋白、卵清蛋白等。2球蛋白类 球蛋白微溶于水而溶于稀中性盐溶液，如血清球蛋白、肌球蛋白和大豆球蛋白等。 3谷蛋白类 谷蛋白不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱，如米、麦蛋白。 4醇溶谷蛋白类 醇溶谷蛋白不溶于水，溶于70一80乙醇，如玉米蛋白。,5. 精蛋白 精蛋白溶于水及酸性溶液，呈碱性，含碱性氨基酸较多(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，如鲑精蛋白。 6组蛋白 组蛋白溶于水及稀酸溶液，含精氨酸、赖氨酸较多，呈碱性，如珠蛋白。 7硬蛋白 硬蛋白不溶于水、盐、稀酸、稀
8、碱溶液，如胶原蛋白、角蛋白及弹性蛋白等。,第二节 氨基酸化学,一. 蛋白质的水解 二、氨基酸的分类 三、氨基酸的重要物理性质 四、氨基酸的酸碱性质 五、氨基酸的化学反应 (一)-氨基参加的反应 (二)-羧基参加的反应 (三)-氨基和-羧基共同参加的反应 (四)侧链R基参加的反应,一.蛋白质的水解,一百多年前就开始了关于蛋白质的化学研究。在早期的研究中，水解作用提供了关于蛋白质组成和结构的极有价值的资料。蛋白质可以被酸，碱或蛋白酶催化水解，在水解过程中，逐渐降解成分子量越来越小的肽段，直到最后成为氨基酸的混合物。根据蛋白质的水解程度，可分为完全水解和部分水解两种情况。完全水解得到的水解产物是各种
9、氨基酸的混合物。部分水解得到的产物是各种大小不等的肽段和氨基酸。下面简略地介绍酸、碱和酶三种水解方法及其优缺点： 酸水解：常用硫酸或盐酸进行水解。使用盐酸，浓度为6molL，硫酸4molL，回流煮沸20小时左右可使蛋白质完全水解。酸水解的优点是不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。缺点是色氨酸完全被沸酸所破坏，羟基氨基酸(丝氨酸及苏氨酸)有一小部分被分解，同时天冬酰胺和谷胺酰胺的酰胺基被水解下来。,碱水解：一般与5molL氢氧化钠共煮1020小时，即可使蛋白质完全水解。水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，所得产物是D-型和L-型氨基酸的混合物，称消旋物。此外，碱水解引起精氨
10、酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。然而在碱性条件下色氨酸是稳定的。 酶水解：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。然而使用一种酶往往水解不彻底，需要几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解。此外，酶水解所需时间较长。因此酶法主要用于部分水解。常用的蛋白酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶以及胃蛋白酶等，它们主要用于蛋白质一级结构分析以获得蛋白质的部分水解产物。,二、氨基酸的分类,从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种，但是参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有二十种。此外在某些蛋白质中还存在若干种不常见的氨基酸，它们都是在已合成的肽链上由常见的氨基酸经专一酶催化的化学修饰转化而来的。180多种天然氨基酸大多数是不参与蛋
11、白质组成的，这些氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。前面的二十多种氨基酸称为蛋白质氨基酸。 中性AA （1）按R基团的酸碱性分 酸性AA 碱性AA,(2)按侧链R基的结构,(3) 按侧链R基的极性,必需氨基酸：指人(或其他脊椎动物)自己不能合成，需要从饮食中获得的氨基酸，例如缬、亮、异亮、苏、赖、蛋、苯丙、色，为八种必需氨基酸。 非必需氨基酸：指人(或其他脊椎动物)自己能由简单的前体合成的，不需要由饮食供给的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。,(一)常见的氨基酸 从蛋白质水解物中分离出来的常见氨基酸有二十种，除脯氨酸外，这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸
12、。结构通式如下：,由通式分析，除脯氨酸（-亚氨基酸）和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为： 1.组成蛋白质的基本氨基酸为-氨基酸。 2不同的-氨基酸，其R侧链不同。它对蛋白质的空间结构和理化性质有重要的影响。 3除R侧链为氢原子的甘氨酸外，其他氨基酸的-碳原子都是不对称碳原子(手性碳原子)，可形成不同的构型，具有旋光性质。天然蛋白质中基本氨基酸皆为L-型，故称为L-型-氨基酸。 -氨基酸都是白色晶体，熔点很高，一般在200以上。每种氨基酸都有特殊的结晶形状。,-氨基酸的分子构型,(二).不常见的蛋白质氨基酸 蛋白质组成中，除了上面20种常见的基本氨基酸之外，从少数蛋白质中还分离出一
13、些不常见的特有的氨基酸。这些特有的氨基酸都是由相应的常见氨基酸衍生而来的。其中有4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸都可在结缔组织的纤维状蛋白质胶原中找到。,三、氨基酸的重要物理性质,一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异 溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。 (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通
14、常用（-）表示，右旋者用（+）表示。 (5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm波长处，因此能利用分光光度法很方便地测定蛋白质的含量。,天然蛋白质分子的20种氨基酸，以色氨酸和酪氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。,紫外吸收性质：,但是当氯原子的邻位和/或对位有强的吸电基时，水解就变的较容易，且吸电基越多
15、，反应越容易进行。,四、氨基酸的酸碱性质,研究氨基酸的酸碱性质对于理解蛋白质的性质具有特别重要的意义。氨基酸的酸碱性质也是氨基酸分离、鉴定和定量分析法的基础。 1.氨基酸的两性电离性质 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化,PH pI pI pI 净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子 等电点pI,2氨基酸的等电点 当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷
16、为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 硷性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,溶液pH值与氨基酸等电点pI的关系,各种氨基酸都有其特定的等电点。中性氨基酸的pI在微酸性；碱性氨基酸的pI在碱性pH范围；酸性氨基酸的pI在酸性pH范围。
17、氨基酸在等电点时溶解度最小，易发生沉淀。工业上利用这一性质提取氨基酸。,对有三个可解离基团的氨基酸例如天冬氨酸和赖氨酸来说，只要写出它的解离公式，然后取兼性离子两边的pK值的平均值，则得其pI值，天冬氨酸解离如下：,等电点时，天冬氨酸主要以兼性离子(R0)存在，R+和R-很小而且相等，R2-的量可忽略不计，因此：,=1/2(2.09+3.86)=2.98,五、氨基酸的化学反应,氨基酸的化学反应主要是指它的-氨基和-羧基以及侧链上的功能团所参与的反应。 (一)-氨基参加的反应 (1)与亚硝酸反应： 氨基酸的氨基也和其他的伯胺一样，在室温下与亚硝酸作用生成氮气，其反应式如下：,在标准条件下测定生成
18、的氮气体积，即可计算出氨基酸的量。此法可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。这里值得注意的是生成的氮气(N2)只有一半来自氨基酸。 此外应该指出，除-NH2外，赖氨酸的-NH2也能与亚硝酸反应，但速度较慢；-NH2作用3-4分钟即反应完全。,(2)与酰化试剂反应,氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。,酰化试剂有苄氧甲酰氯,叔丁氧甲酰氯，对-甲苯磺酰氯以及邻苯二甲酸酐等。这些酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。它们的化学结构如下所示：,（R酰基）,苄氧酰氯（Cbz-Cl）:,对甲苯磺酰氯(Tos-Cl) :,叔丁氧酰氯(Boc-Cl):,邻苯二甲
19、酸酐：,Cbz-Cl,Cbz-氨基酸,(3)与丹磺酰氯的反应（dansyl chloride,DNS）,氨基酸的-氨基或肽链N-末端游离的-氨基可以与二甲氨基萘磺酰氯(简称丹磺酰氯，或用DNSC1表示)起反应生成丹磺酰氯的衍生物。由于丹磺酰氯是一种萤光试剂，与-氨基反应所生成的丹磺酰衍生物具有很强的萤光，可用于微量分析。故丹磺酰氯在肽链N-端氨基酸分析中是很有用的试剂。,5-二甲氨基萘磺酰氯（ ）,B.芳基锂试剂的合成,(4)烃基化反应,与2，4-二硝基氟苯简写为( DNFB或FDNB)在弱碱性溶液中发生亲核芳环取代反应而生成二硝基苯基氨基酸(简称为DNP-氨基酸（黄色）)。这个反应首先被英国
20、的Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的-NH2末端氨基酸。其反应可表示如下:,应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 虽然多肽侧链上的- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与- DNP氨基酸区分和分离,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A. 肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 B. 水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C. 分离DNP-氨基酸 D. 层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目 (5)与苯异硫氰酸(PITC)的反应(Edman降解) 由Edman于1950年首先提出 为- NH2的反应 用于N末端分析，又称Edman降解法。
21、此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 a. 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 b. 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和 少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 c. 分离PTH-氨基酸 d. 层析法鉴定,Edman降解法的改进方法- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸，原理DNFB法相同，但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定。由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍，可用于微量氨基酸的定量。用Edman降解法提供
22、逐次减少一个残基的肽链，灵敏度提高，能连续测定。多肽顺序自动分析仪，样品最低用量可在5pmol。,(6)与甲醛反应,OH-,中和滴定,反应特点 A.为- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。,应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。 （7）成盐作用,(二) -羧基参加的反应 氨基酸的羧基和其他有机酸的羧基一样，在一定的条件下可以发生成
23、盐、成酯，成酰氯、成酰胺以及脱羧和叠氮化等反应。,(1)成盐和成酯反应： 氨基酸与碱作用即生成盐，例如与氢氧化钠反应得氨基酸钠盐，其中重金属盐不溶于水。氨基酸的羧基被醇酯化后，形成相应的酯。氨基酸酯是制备氨基酸的酰胺或酰肼的中间物。,当氨基酸的羧基变成甲酯、乙酯或钠盐后，羧基的化学反应性能即被掩蔽或者说羧基被保护，而氨基的化学反应性能得到加强或说氨基被活化，容易和酰基或烃基结合，这就是为什么氨基酸的酰基化和烃基化需要在碱性溶液中进行的原因。,(2)成酰氯反应 氨基酸的氨基如果用适当的保护基，例如苄氧甲酰基保护后，其羧基可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯：,这个反应可使氨基酸的羧基活化，使它容易
24、与另一氨基酸的氨基结合，因此在多肽人工合成中是常用的。,酰化氨基酸对-硝基苯酯,（活化酯）,(3)脱羧基反应 在生物体内氨基酸经氨基酸脱羧酶作用， 放出二氧化碳并生成相应的一级胺：,(4)叠氮反应,氨基酸的氨基通过酰化加以保护，羧基经酯化转变为甲酯，然后与胼和亚硝酸反应即变成叠氮化合物。此反应使氨基酸的羧基活化。氨基酸叠氮化合物常用于肽的人工合成。,H2NCHRCOOH,脱羧酶,H2N-CHR-COOH,NH2NH2,（-CH3OH）,HNO2,(三)-氨基和-羧基共同参加的反应,(1). 与茚三酮的反应（颜色反应） 茚三酮在弱酸性溶液中与-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮
25、与反应产物-氨和还原茚三酮发生作用，生成紫色物质。Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几g）。,用纸层析或柱层析把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性或定量测定各种氨基酸。定量释放的CO2，可用测压法测量，从而计算出参加反应的氨基酸量。,反应要点 A. 该反应由NH2与COOH共同参与 B. 茚三酮是强氧化剂 C. 该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值 D. 测定范围：在450nm处有最大吸收率，在0.550 g / ml范围内，氨基酸含量与光密度成正比。 E. 脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3） 应用： A. 氨基酸定量分
26、析（先用层析法分离） B. 氨基酸自动分析仪： 用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。,（2）成肽键,一个氨基酸的 氨基和另一个氨基酸 羧基脱水缩合，生成的酰胺叫做肽，这种酰胺键叫做肽键。,(四) 侧链R基参加的反应 (1)与5,5-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应(-SH的反应) 测定细胞游离- SH的含量,硫代硝基苯甲酸,（2）-S-S-和-SH的氧化还原反应,R-SH：HS-CH2CH2OH 巯基乙醇（mercaptoethanol）,HS-CH2COOH 巯基乙酸（mercaptoacetic acid）,HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（di
27、thiothreitol, DTT）,半胱氨酸的-SH很活泼，很容易在空气中重新氧化形成二硫键，一般可用卤代化物对-SH进行保护。,第三节 蛋白质的结构,一、蛋白质分子的一级结构 (一) 肽键和肽链 (二) 蛋白质一级结构测定的原理 (三) 多肽链人工合成的基本原理 二、蛋白质的构象 (一)蛋白质分子中的非共价键(次级键) (二)蛋白质的二级结构 (三)蛋白质的三级结构 (四)蛋白质的四级结构 (五)维持蛋白质构象的化学键,一、蛋白质分子的一级结构,蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连而成的高分子物质，分子量很大一般在61031106道尔顿之间，要了解蛋白质的结构，首先必须了解一特定蛋白质的组成氨
28、基酸种类、含量、相互连接的化学键、所含氨基酸的排列顺序及各种蛋白质的长链的空间排布。 蛋白质的一级结构是指组成氨基酸如何连接成肽链以及其在肽链中的排列顺序。 (一)肽键和肽链 1.一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链。通常在多肽链的一端含有一个游离-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。氨基酸的顺序是从
29、N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。,N端,氨基酸残基,氨基酸残基,C端,2.肽链书写方式：N端C端,氨基酸之间用“-”表示肽键,H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOH,Ser-Leu-Phe,（S-L-F）,如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,3.命名：根据氨基酸组成，由N端C端命名,丙氨酰甘氨酰亮氨酸 (AlaGlyLeu ),肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面，这一平面称为肽键平面（肽单元） 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,4. 肽键平
30、面的形成,肽键平面示意图,多肽链的一级结构存在有三种形式，即无分支开链多肽、分支开链多肽和环状多肽。环状多肽是由开链多肽的末端氨基与末端羧基缩合形成一个肽键的结果。,5肽两性解离与等电点,肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。 由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2。R基的pK变化不大。 肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值。,例：已知末端-COOH，pK3.6，末端-NH3+pK8
31、.0 -NH+3pK10.6。 计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。,pI=(8.010.6) /2 =9.3,6.天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。 促肾上腺皮质激素（ACTH） 39肽，活性部位为第410位的7肽片段： Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly 脑肽 脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。,甲硫氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyphe- Met,亮氨酸
32、脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu,谷胱甘肽（glutathione, GSH）： 是一种称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸的三肽化合物。,还原型与氧化型谷胱甘肽的相互转变,Glu-Cys-Gly | S | S | Glu-Cys-Gly,谷胱甘肽分子中的巯基可氧化或还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。,2 Glu-Cys-Gly | SH,解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用
33、。,谷胱甘肽的生理功用：,催产素和升压素：均为9肽，第3位和第8位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。,蛋白质与多肽的区别：,凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质； 凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。,一级结构的分析是一项非常细致而又复杂的技术上作，基本工作程序是： （1）将蛋白质纯化，测定末端组成。 （2）拆分蛋白质分子并将多肽分离纯化。 （3）用酶法或化学方法进行专一性切割，得到系列长短不一的肽段。 （4）将肽段分离，通过末端分析方法测定各肽段的氨基酸顺序。 （5）
34、根据二肽段的顺序重叠关系确定各个肽段的衔接顺序。排出完整多肽链的氨基酸顺序。 （6）确定二硫键的位置。,(二) 蛋白质一级结构测定的原理,1. 重迭顺序法 将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。 不同的方法水解部位不同，但从这些已知氨基酸顺序的小肽片段中可找到关键性的“重迭顺序”，这样便可确定各小肽片段在整个大肽中的位置，从而推断出大分子多肽的氨基酸排列顺序。,例如，有一多肽用A法限制性水解得三个小肽片段，其顺序分别为： 蛋苯丙 甘丝 缬赖酪丙 单用A法的结果很难确定这三个小肽片段是怎样连接的。经B法限制性水解此多肽得两个小肽片段，其顺序
35、分别为： 酪丙蛋苯丙 甘丝缬赖 单用B法也难确定其顺序。综合A、B两法的结果，可找到其关键性的“重迭顺序”为“缬赖酪丙”。这样即可推论出此多肽的氨基酸排列顺序为： 甘丝缬赖酪丙蛋苯丙 目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。,2多肽链的末端氨基酸分析,(1)N末端氨基酸的分析 N-末端分析不仅有助于确定氨基酸顺序，还有助于确定蛋白质由几条多肽链组成。常用的方法有三种。 a.二硝基氟苯(DNFB)法： 蛋白质或多肽的N-末端氨基与DNFB反应，生成DNP-肽衍生物。由于DNP基团与氨基结合牢固，不易被酸水解。因此，当用酸水解DNP-肽时，所有肽键被拆开，而DNP-基团仍连在N-
36、末端氨基酸上，这好象给N-末端以标记，以区别水解液中的非N-末端氨基酸。DNP-氨基酸可用乙醚抽提出来而与其他氨基酸分开。分离出的DNP-氨基酸可用纸层析或聚酰胺薄膜层析进行定性和定量分析。,b.二甲氨基萘磺酰氯法,又称丹磺酰氯法。DNS-Cl是一种荧光试剂，它能与多肽的N-末端氨基反应生成DNS-多肽，经水解得DNS-氨基酸。用乙酸乙酯抽提，再用层析法鉴定。DNS-氨基酸在360nm或280nm产生强烈的荧光，其灵敏度高于DNFB法约100倍，检测灵敏度可以达到110 -9mol。本法反应原理同DNFB法。,c.苯异硫腈法(Edman法)：,苯异硫腈(PITC)能与多肽的N-末端氨基反应，生
37、成苯氨基硫甲酰衍生物(PTC-多肽)。在酸性溶液中，PTC-多肽经环化、水解生成苯乙内酰硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)和剩余多肽(N-末端少一个氨基酸的多肽)。PTH-氨基酸可用乙酸乙酯抽提后进行鉴定。由于PITC与肽链的游离-末端氨基结合后，只切下与PITC反应的那个氨基酸残基。这时在减少了一个残基的肽链N-端便暴露出一个新的游离-末端氨基，剩余多肽可再与PITC重复上述反应，逐步递减N-末端氨基酸，称为Edman顺序降解法，这是PEdman于1950年首先提出来的。Edman降解反应可分为如下三步：,(2)C-末端氨基酸的分析,一般说宋，C-末端分析比N-末端分析的误差大。 a.羧肽酶法：羧
38、肽酶能特异地水解C-末端氨基酸的肽键，而用于测定C-末端氨基酸的顺序。羧肽酶主要有A、B、C、Y四种，羧肽酶A可水解脂肪族或芳香族氨基酸构成的C-末端肽键；羧肽酶B则水解由碱性氨基酸构成的C-末端肽键；羧肽酶C可水解C-端为Lys、Arg和Pro的肽键；羧肽酶Y能释放所有的氨基酸，是一个十分有用的酶。用羧肽酶分析C-末端的方法是从酶水解液中定期取样晶进行分析，并依据其出现的先后而确定C-末端氨基酸的排列顺序。因为酶对各种氨基酸所形成肽键的水解速度不完全相同，所以有时对结果较难分析。,4种羧肽酶的来源和专一性,b.肼解法：,多肽与无水肼于100反应510h后，C-末端氨基酸以自由形式释出，而其他
39、氨基酸则生成相应的酰肼化合物。后者与苯甲醛反应生成不溶于水的二苯基衍生物，经分离后上清液可用层析法作C-末端氨基酸的鉴定，也可与DNFB或DNS-Cl作用后再鉴定。,c. 硼氢化锂还原法,3肽链的部分水解和肽段的分离,一般说来，上述方法可直接确定十肽左右小肽的氨基酸顺序。长肽链不易测定，须分解成适当大小后再作顺序分析。分解肽链的方法有酶水解法和化学分解法两大类。为确定蛋白质分子中氨基酸的排列顺序常先选用两种以上的方法将肽链部分水解为小肽片段。通常采用多种蛋白酶如胰蛋白酶、凝乳蛋白酶等在专一的肽键处切开肽链，或用化学方法进行部分水解，分离肽段，测定它们的氨基酸排列顺序。 化学分解法中以溴化氰法最
40、为理想，它能专一性地分解蛋白质中蛋氨酸羧基侧肽键。在酸性条件下，溴化氰使蛋氨酸残基分解，转化成C-末端高丝氨酸内酯，并释放出新的N-末端。此法的特点是专一性强，产率高。特别有意义的是，一般多肽中所含的甲硫氨酸数目较少，而且分布也比较分散，可以得到较理想的小肽段。反应式如下：,4二硫键位置的确定,二硫键可使几条肽链相连。进行蛋白质一级结构分析时，往往要打开二硫键。通常用过甲酸氧化，使胱氨酸部分氧化成2个磺基丙氨酸。或用过量巯基化合物使二硫键切断而还原为相应的巯基化合物。,当二硫键在两条肽链之间，则二硫键拆开后蛋白质的分子量有显著改变。如二硫键相连于同一条链的不同部位，则拆开二硫键后仅使肽链伸展而
41、分子量并不改变。因此，在分析蛋白质一级结构、确定二硫键位置和肽链形状时，拆开二硫键的方法是很重要的。 确定二硫键的位置常用对角线电泳技术。方法是：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在pH6.5的条件下，进行第一相电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽。滤纸旋90角，在与第一相完全相同的条件下进行第二相电泳。这时大多数肽段的迁移率未变，并位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段(未用
42、茚三酮显色的)分别取下，进行氨基酸顺序分析，然后与多肽链的氨基酸顺序比较，即可推断出二硫键在肽链间或肽链内的位置。,(三) 多肽链人工合成的基本原理,1蛋白质人工合成的意义 人工合成蛋白质和多肽标志着人类在揭开生命奥秘的伟大历程中迈进了一大步。由于一些天然蛋白质和多肽一级结构的阐明，用人工方法来合成具有生物活性的多肽或蛋白质，已成为蛋白质化学中十分活跃的领域。 20世纪初 E. Fischer：以氨基酸为原料合成了一个十八肽。 1932年 M.Bergman: Cbz 1953年 美国 Du.Vigneaud：生物活性的催产素 1965年 中国：生物活性的牛胰岛素 1962年 美国Merrif
43、ield：固相合成法,2化学合成多肽的主要步骤,多肽的化学合成一般可分为三个阶段； (1)基团保护 为使所需的不同氨基酸能按定向顺序控制合成，应防止其他不该参与反应的基团发生反应，如N-端的自由氨基，C-端的自由羧基，侧链上的一些活性基团(如-SH、-OH、-NH2和-COOH等)，因此需将这些基团加以封闭或保护，以免生成不需要的肽键或其他化学键而使反应复杂化。 保护基应具备的条件是：在接肽缩合时起保护作用，接肽后易除去而不引起合成肽键的断裂。,a氨基的保护方法 氨基是亲核性很强的基团。氨基经酰化后，亲核性消失，因此对游离氨基实施酰基化，是保护氨基的基本方法。但是，考虑到肽键形成后，应能在温和
44、条件下将保护基除去，因此对于氨基保护基有特殊要求 氨基保护基Y：Cbz、Boc、Tos,b羧基的保护方法 氨基酸中不参加反应的羧基也必须进行保护。通常是用形成酯基的方法进行保护。 羧基保护基Z：甲酯（OMe）CH3O- 乙酯（OEt）C2H5O-,苄酯（OBzl）,叔丁酯（OBut）,(2)接肽缩合反应 要使一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基通过缩合反应形成肽键。常用的有以下几种： a.羧基活化方法 酰基叠氮法： 此法的优点是不易引起氨基酸消旋化。,活性酯：,酰基叠氮在使用和储存时容易分解，通常将它与N-羟基丁二酰亚胺反应，产物是一种稳定的结晶化合物，称为“活性酯”。,另一种重要的活性酯是：
45、,活性酯与氨基反应可以形成酰胺键。,b.用偶联剂的方法,偶联剂本身是一种能帮助羧基与氨基之间产生脱水和缩合反应的试剂。 缩合剂：N，N一二环己基碳二亚胺（N，N-dicyclohexyl carbodiimide，缩写DCCI或DCC）,(3)去保护基,根据保护基的性质可用适当的方法除去保护基，即得肽化合物。 脱去氨基保护基的方法： Cbz用催化加氢法 Boc用酸，如50%三氟醋酸脱去 Tos用钠氨还原法 脱去羧基保护基的方法： 甲酯或乙酯用皂化法 苄酯（OBzl）用催化加氢法 叔丁酯（OBut）用酸，如50%三氟醋酸脱去,1 2 3,3多肽合成的策略,多肽合成可以选择两种不同的策略：一是肽链
46、逐步增长法，在多肽合成过程中，氨基酸残基是一个一个依次加上去的；另一种是片断组合法，先合成一些小的肽段，然后再将小肽段偶联成多肽。从下列比较中可以看出它们之间的优缺点。对于合成相对分子质量不大的多肽，两种方法都可以采用。但是如果要合成相对分子质量大的多肽，则一般应采用片断组合法。 例如，合成含有32个氨基酸残基的多肽，如果要求总的产率为30，对于片断组合法，则要求每一步的平均产率为78；而对于肽链逐步增长法，则要求每一步产率为96.2。,二种多肽合成策略比较 (合成一个多肽abcdefgh) 肽链逐渐增长法 片断组合法 gh ab cd ef gh fgh abcd efgh efgh abcdefgh defgh cdefgh bcde