130320微生物的生长与控制6学时.ppt

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1、第六章 微生物的生长与控制 （6学时）,第一节 微生物的群体生长（2学时） 第二节 环境对微生物生长的影响（2学时） 第三节 微生物生长的控制（2学时）,第一节 微生物的群体生长,一、微生物群体生长的测量 二、细菌的生长曲线 三、分批培养和连续培养,一、微生物群体生长的测量,（一）细胞数量的测定 （二）生物量的测定,（一）细胞数量的测定,细胞总数：包括活的细胞和已丧失生活能力的细胞，多数情况下更关注计算活菌数 测定方法：显微镜计数法、比浊法、 稀释平皿法等,、显微镜直接计数法,直接计数法：仅适用于单细胞的微生物类群，测定时需用细菌计数器或血细胞计数板在普通光学或相差显微镜下直接观察并记录微生物

2、细胞数 用于直接测数的菌悬液浓度一般不宜过低或过高：细菌为107-1010个/ml；酵母菌和真菌孢子应为104-106个/ml,菌液中的总菌数 =A/516104B=32000AB (个/ml）,大方格体积=0.1mm3 1ml菌液=104个大方格 设菌液稀释倍数为B,直接计数法的优缺点,优点：快捷简便、容易操作 缺点：不能区分死菌与活菌及形状与微生物相似的颗粒性杂质；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察,、比浊测数法,比浊法：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比；因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度（OD） ，就可计算出菌液的浓度 实验测量时应控

3、制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确,比浊法的优缺点,优点：快速、简便 缺点：易受干扰,、稀释平皿测数法,活菌计数法：理论上在高度稀释条件下的每一个活的单细胞均能繁殖成一个菌落，因而可以用培养的方法使每个活细胞生长成一个单独的菌落，并通过长出的菌落数去推算菌悬液中的活菌数,每毫升菌液活菌数（CFU/ml） （同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数 /涂平板菌液体积）稀释倍数,活菌计数法的优缺点,优点：本法是迄今仍广泛采用的主要活菌计数方法 缺点：麻烦费工费时，而且在混合微生物样品中只能测定出优势菌,、液体稀释培养计数法,最大或然数法(most probable number，MPN)

4、：利用待测微生物生理功能的选择性来摆脱其它类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该群微生物的存在和丰度,最大或然数法的优缺点,优点：适用于含菌量少的样品或一些在固体培养基上不宜生长的细菌样品，如污水、牛奶的微生物数量 缺点：只能进行特殊生理群的测定，结果也较为粗放,、滤膜浓缩法,滤膜法：测定时让样品通过特殊的微生物收集装置(如微孔滤膜等)，富集其中的微生物，然后将收集到的微生物洗脱后测数，再换算成原来水或空气中的数量,滤膜法的优缺点,优点：该法适用于检测空气、水等体积大而且含菌浓度较低的样品中的活菌数 缺点：结果也较为粗放,一、微生物群体生长的测量,（一）细胞数量的测定 （二）生物量的测定,

5、（二）生物量的测定,生物量：是指一种生物单位体积的重量，多以克为计量单位 测定方法：细胞干重法、DNA含量测定法、 总氮量测定法、代谢活性法等,、细胞干重法,细胞干重法：将单位体积的微生物培养液经离心收集并用水反复洗涤菌体，经常压或真空干燥后精确称重，即可计算出培养物的总生物量 一般每1mg细菌干重约等于45mg湿菌鲜重和相当于45109个细胞，可以此作标准从干重作需要的转换 本法适用于含菌量高，不含或少含非菌颗粒性杂质的环境或培养条件,、DNA含量测定法,DNA含量测定法：微生物细胞中的DNA含量较为稳定，可以根据分离出的样品中的DNA含量来计算微生物的生物量 经测定大肠杆菌每个细胞平均含8

6、.410-5ng DNA ，其细胞的DNA含量为34,、总氮量测定法,总氮量测定法：蛋白质是微生物细胞的主要含氮有机物，核酸、类脂等中也含有一定量的氮素；通过化学分析方法测出待测样品的含氮量，从而推算出细胞的生物量 已知细菌细胞干重的含氮量一般为1215 本法适用于在固体或液体条件下微生物总生物量的测定，但需充分洗涤菌体以除去含氮杂质，缺点是操作程序较复杂，除必需外很少采用,、代谢活性法,代谢活性法：根据微生物的生命活动强度来估算其生物量；如测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物或02的数量，或者是测定微生物代谢过程中的产酸量或CO2量等，均可以在一定程度上反映微生物的生物量 本法系间接法

7、，影响因素较多，误差也较大，仅在特定条件下作比较分析时使用,二、细菌的生长曲线,（一）延缓期 （二）对数期 （三）稳定期 （四）衰亡期,细菌的生长曲线,生长曲线(growth curve)：细菌接种定量的液体培养基，在培养过程中定时取样测数，然后以时间为横坐标，活菌数的对数为纵坐标，绘出一条类似于S形的曲线；该曲线反映细菌在整个培养期间菌数的变化规律 一条典型的生长曲线可分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期,（一）延缓期,延缓期(lag phase)：指接种新鲜培养液的细菌，因代谢系统适应新环境的需要，细胞不分裂，数目没有增加的一段时期 迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的

8、环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时,缩短迟缓期的常用手段,通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短 利用对数生长期的细胞作为种子 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大 适当扩大接种量,二、细菌的生长曲线,（一）延缓期 （二）对数期 （三）稳定期 （四）衰亡期,（二）对数期,对数生长期(Log phase)：指细菌代谢旺盛，分裂迅速，单位时间内细胞数量呈几何级数增长的时期 对数期在生长曲线上表现为一条上升的直线,世代时间,世代时间（G）：细菌在对数期每分裂一次所需时间，计算公式如下： G = t/n = t/3.3(lgNt-lgN0)=0.301t/(lgNt-lgN

9、0) t：细胞分裂n代所需总时间；n：繁殖世代数；N0：对数期开始时细菌数；Nt：对数期t时细菌数,影响代时长短的因素,菌种：不同菌种代时差别显著 培养基成分：在营养丰富的培养基中生长代时短，培养基成分还可影响菌种的生长总量 培养温度：在一定范围，代时与培养温度呈负相关,二、细菌的生长曲线,（一）延缓期 （二）对数期 （三）稳定期 （四）衰亡期,（三）稳定期,稳定生长期(Stationary phase)：细菌经过对数期的旺盛生长后，某些营养物质开始缺乏，pH和Eh等发生变化，限制了菌体的生长和分裂，使细胞死亡数与增长数接近平衡 这一时期内，细胞开始累积储藏物质（如糖原、异染粒等）或合成次生代

10、谢产物，芽孢菌内开始产生芽孢,菌体产量,生长产量常数（生长得率，growth yield， Y ） ：表示细菌对基质利用效率的高低，反映了菌体产量与营养物质消耗之间的比例关系，即： X为稳定期的细胞干重，x0为刚接种时的细胞干重， C0为限制性营养物的最初浓度， C为稳定期时限制性营养物的浓度,延长稳定期的常用手段,补料：补充营养物质，同时取走代谢产物 恢复培养条件：调节pH、调节温度、增加通气量等,二、细菌的生长曲线,（一）延缓期 （二）对数期 （三）稳定期 （四）衰亡期,（四）衰亡期,衰亡期（death phase）：营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡率逐步增加和活细菌逐步减少

11、，标志进入衰亡期 该时期细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶；细胞常表现为多形态，产生许多畸形细胞，其革兰氏染色亦不稳定，许多G+细菌的衰老细胞可能表现为G-,四、分批培养和连续培养,（一）分批培养和连续培养 （二）连续培养的两种方式,（一）分批培养和连续培养,分批培养（batch culture）：采用完全封闭的容器，一次接种，静置培养，最后一次收获培养基的培养方法 连续培养(continous culture）：在整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的培养方法,连续培养的优缺点,连续发酵与分批发酵相比的优点：缩短发酵周期，提高设备利用率，降低产品成本

12、；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定 连续发酵与分批发酵相比的缺点：营养基质的利用率低；培养时间长，杂菌污染的机会增多；菌种退化,四、分批培养和连续培养,（一）分批培养和连续培养 （二）连续培养的两种方式,（二）连续培养的两种方式,连续培养的原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率 连续培养的方式：恒浊培养-保持恒定的混浊度；恒化培养-保持恒定的流速,1、恒浊培养,恒浊连续培养：通过光电装置自动测定并藉调节加入

13、培养液的流速来保持培养物浊度恒定的培养方法 恒浊培养一般采用较高浓度养料的完全培养基，没有限制生长的营养成分，可以使菌体维持最高的生长速率 当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高,恒浊培养的使用范围,恒浊培养可用于生产大量菌体 恒浊培养也可用于生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等,2、恒化培养,恒化连续培养：是在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定，从而保持细菌比生长速率恒定的培养方式 限制性因子：必须是菌体生长所必需的营养物质（如氨基酸、葡萄糖、无机盐等），并将其控制在较低的浓度，而其他营养

14、物均过量 细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率,恒化培养的使用范围,通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物 多用于科研，如突变株分离、不同条件下的代谢变化、模拟自然营养条件建立实验模型等,3、恒浊器与恒化器的比较,第七章 微生物的生长与控制 （6学时）,第一节 微生物的群体生长（2学时） 第二节 环境对微生物生长的影响（2学时） 第三节 微生物生长的控制（2学时）,第二节 环境对微生物生长的影响,一、温度 二、水分及其可给性 三、氢离子浓度 四、氧气和氧化还原电位 五、辐射 六、化学杀菌剂和抑菌剂,影响微生物生长的环境条件,影响微生物生长的环境条件主要有物理

15、、化学和生物因子三大方面 本节将讨论属于前二类的温度、水分、pH、02、氧化还原电位、辐射和化学药剂等对微生物生长的影响,一、温度,（一）微生物的生长温度类型 （二）温度对微生物的影响 （三）致死温度与致死时间,最适生长温度,最低温度：是指微生物能生长的温度下限；在此温度范围内，微生物尚能缓慢生长 最高温度：是指微生物能生长的温度上限；在此温度下，微生物尚能生长，而超过该温度时，微生物立即停止生长或死亡 最适温度：最适合生长的温度；在此温度范围内，微生物迅速生长,（一）微生物的生长温度类型,低温型微生物（psychrophiles）：嗜冷微生物 中温型微生物（mesophiles） ：嗜温微生

16、物 高温型微生物（thermophiles） ：嗜热微生物,1、低温型微生物,主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中，如假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败 低温生长机理：代谢酶在低温下活性较高；细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，使膜在低温下保持半流动状态和较高生理活性,2、中温型微生物,自然界中绝大多数微生物种类属于这种类型，适于在2540生长 广泛分布于土壤、水、空气和动植物上，以及哺乳动物生活的各种环境中,3、高温型微生物,主要分布在温泉、堆肥和土壤中：嗜热微生物的最适温度在4560，存在于堆肥和沼气发酵池等环境中；极端嗜热微生物的最适温度在7090，存在

17、于温泉和大洋底火山喷口等处 高温微生物的生长机制：酶、蛋白质以及核糖体有较强的抗热性；核酸G+C含量高，具有较高的热稳定性；细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液晶状态,一、温度,（一）微生物的生长温度类型 （二）温度对微生物的影响 （三）致死温度与致死时间,（二）温度对微生物的影响,从总体上看，微生物生长和适应的温度范围从-12100或更高，每种微生物具有最低、最适和最高三个临界值 超过最高温度：蛋白质凝固；酶变性失活；代谢停滞死亡 低于最低下限：冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏，造成细胞脱水,一、温度,（一）微生物的生长温度类型 （二）温度对微生物

18、的影响 （三）致死温度与致死时间,（三）致死温度与致死时间,致死温度（Lethal temperature）：10min内杀死某种微生物的高温界限；大多数细菌、病毒、酵母菌和真菌菌丝的致死温度为50-66，放线菌和真菌孢子为75-80 ，细菌芽孢在100 以上 致死时间（Lethal time）：在某一温度下杀死细胞所需的最短时间,二、水分及其可给性,（一）水的活度 （二）微生物的最适w值,（一）水的活度,水的活度：环境中水的可给性，一般用水的活度值（w)为指标，即指在一定温度和压力条件下，溶液的蒸汽压力与纯水蒸气压力之比，即： w =P/P0 纯水的w =1；溶质越多， w值越小；土壤中w在

19、0.99至1.00之间 微生物生长所要求的w值通常在0.660.99之间，每一种微生物都有其最适w值,二、水分及其可给性,（一）水的活度 （二）微生物的最适w值,（二）微生物的最适w值,细菌：最适w =0.930.99 大多数酵母：最适w =0.880.91 丝状真菌：最适w =0.80 嗜盐细菌：最适w =0.76；地衣和嗜干燥真菌：最适w =0.600.70,三、氢离子浓度,（一）微生物的最适pH值 （二）pH对微生物的影响 （三）pH的变化与调节,（一）微生物的最适pH值,嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：部分细菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 耐酸微生物

20、：大部分酵母菌和霉菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌 嗜酸微生物：硫杆菌属,三、氢离子浓度,（一）微生物的最适pH值 （二）pH对微生物的影响 （三）pH的变化与调节,（二）pH对微生物的影响,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力 改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性,三、氢离子浓度,（一）微生物的最适pH值 （二）pH对微生物的影响 （三）pH的变化与调节,（三）pH的变化与调节,四、氧气和氧化还原电位,（一）微生物的需氧性 （二）Eh

21、对微生物的影响 （三）改变Eh值的方式,（一）微生物的需氧性,严格需氧菌：包括大多数细菌、几乎全部的放线菌和丝状真菌，它们只能在有氧的条件下生长 兼性厌氧菌：包括部分细菌和酵母菌，在有氧条件下较好生长，也能在无氧条件下生长一段时间 微需氧菌：属于本类的微生物种类不多，只能在含氧量为2-10的微好气条件下生长，如嗜盐片球菌 严格厌氧菌：主要包括部分细菌和原生动物中的少数类群，它们只能在无氧的条件下生长,四、氧气和氧化还原电位,（一）微生物的需氧性 （二）Eh对微生物的影响 （三）改变Eh值的方式,（二）Eh对微生物的影响,Eh值即氧化还原电位，能综合反映环境的氧化还原状况 各种微生物要求不同的E

22、h值 好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长，以+0.3+0.4伏为宜； 厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长； 兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，+0.1伏以下时进行发酵,四、氧气和氧化还原电位,（一）微生物的需氧性 （二）Eh对微生物的影响 （三）改变Eh值的方式,（三）改变Eh值的方式,改善通气条件 降低培养基pH 加入氧化性物质，如半胱氨酸、硫化乙醇等 微生物本身的代谢作用,五、辐射,（一）可见光对微生物的影响 （二）紫外线对微生物的影响 （三）电离辐射对微生物的影响,（一）可见光对微生物的影响,可见光：波长在400760nm范围内的电磁波 少数微生物需要光作为能源；部

23、分具有生长趋光性；另外，散射光可以刺激形成子实体 一般，可见光对大多数化能微生物没有影响，但是太强或连续长时间照射也会导致微生物死亡（光氧化作用）,五、辐射,（一）可见光对微生物的影响 （二）紫外线对微生物的影响 （三）电离辐射对微生物的影响,（二）紫外线对微生物的影响,紫外线：波长在100 400nm范围内的电磁波；其中波长在260 280nm处的紫外线杀菌力最强 杀菌原理：紫外线作用于DNA ，使其产生胸腺嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡；另外，紫外线会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧释放的原子氧有杀菌作用 应用：由于穿透力差，只适用于物体表面以及

24、空气、水的消毒杀菌；也用于诱变育种,五、辐射,（一）可见光对微生物的影响 （二）紫外线对微生物的影响 （三）电离辐射对微生物的影响,（三）电离辐射对微生物的影响,电离辐射：、射线 ，波长短，能量高，有较强的杀伤力 杀菌原理 ：可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡 特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用 应用：用于不耐热食品、药品和塑料制品的杀菌或菌种诱变,六、化学杀菌剂和抑菌剂,（一）化学药剂对微生物的影响 （二）灭菌、消毒和防腐,（一）化学药剂对微生物的影响,破坏细胞结构，如苯酚和乙醇等 干扰细胞的能量代谢，如重金

25、属、一氧化碳和氰化物等 干扰细胞物质的合成，如磺胺、氨基酸和核苷酸类似物等,六、化学杀菌剂和抑菌剂,（一）化学药剂对微生物的影响 （二）灭菌、消毒和防腐,（二）灭菌、消毒和防腐,防腐(Antiseptsis)：是在化学物质作用下，防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或其他物质霉变 消毒(Disinfection)：是利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染或传播的作用 灭菌(Sterilization)：是指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施；灭菌后的物体不再有可存活的微生物,第七章 微生物的生长与控制 （6学时）,第一节

26、 微生物的群体生长（2学时） 第二节 环境对微生物生长的影响（2学时） 第三节 微生物生长的控制（2学时）,第三节 微生物生长的控制,一、控制微生物的化学物质 二、控制微生物的物理因素,一、控制微生物的化学物质,（一）抗微生物剂 （二）抗代谢物 （三）抗生素,（一）抗微生物剂,抗微生物剂：是指一类生物合成或人工合成的，能够杀死或抑制微生物生长的化学物质 杀菌剂（消毒剂）：抑制或杀灭病原微生物，对人体有害作用；主要用于物体表面、器械和环境中微生物的杀灭 防腐剂：抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物毒性较低；用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也可用于食品饮料、药品的防腐,石炭酸系数,在

27、临床上最早使用的消毒剂-石炭酸 石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率 一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）,一、控制微生物的化学物质,（一）抗微生物剂 （二）抗代谢物 （三）抗生素,（二）抗代谢物,抗代谢物：是指在结构上与生物体所必需的代谢物很相似的化合物，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行 如叶酸对抗物（磺胺）； 尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶），胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）；苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）等,一、控制微生物的化学物质,（一）抗微生物

28、剂 （二）抗代谢物 （三）抗生素,（三）抗生素,抗生素：是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，在很低浓度时就能杀死微生物或抑制其生长,1、抗生素的作用机制,抑制细菌细胞壁合成 破坏细胞质膜 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化 抑制蛋白质和核酸合成,2、抗药性的发生机制,细胞质膜透性改变，使抗生素不进入细胞或进入细胞后被细胞 主动排出 药物作用靶改变 合成了修饰抗生素的酶 抗性菌株发生遗传变异，导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体,3、抗药性的对策,第一次使用的药物剂量要足 避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素 不同的抗生素(或与其他药物)混合使用 对现有抗生素进行改造 筛

29、选新的更有效的抗生素,二、控制微生物的物理因素,（一）高温灭菌 （二）辐射灭菌 （三）过滤灭菌,1、高温灭菌,巴斯德消毒法： 6366，30min或70 15min，应用于牛奶、饮料和酒类等食品的灭菌 干热灭菌：160-170 ，1-2h，可用于培养皿等各种器皿的灭菌 湿热灭菌：121 ，30min，可用于培养基的灭菌；同一温度下，湿热灭菌比干热灭菌的效果好,二、控制微生物的物理因素,（一）高温灭菌 （二）辐射灭菌 （三）过滤灭菌,（二）辐射灭菌,辐射灭菌：是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法 用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和-射线等,二、控制微生

30、物的物理因素,（一）高温灭菌 （二）辐射灭菌 （三）过滤灭菌,（三）过滤灭菌,过滤灭菌：采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的 应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌,常用的细菌过滤器,实验室常用的滤器：滤膜过滤器、蔡氏过滤器、玻璃过滤器、磁土过滤器等 过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等 滤器孔径：常用0.22 m 、0.45 m,【小结】,名词解释：纯培养、连续培养、水的活度、灭菌、消毒、防腐 测定微生物群体生长有哪些方法？各有何特点和适用范围？ 什么是生长曲线？单细胞微生物的典型生长曲线可分几期？其划分的依据是什么？ 什么叫连续培养？指出连续培养的根据是什么？,【小结】,什么叫最适温度？温度对同一微生物的生长速度、生长量、代谢速度、各代谢产物累积量的影响是否相同？研究这一问题有何实践意义？ 什么叫水活度？它对微生物的生命活动有何影响？ 在微生物培养过程中，引起pH值改变的原因有哪些？在实践中如何保证微生物能处于较稳定和合适的pH环境中？ 为什么不能滥用抗生素，你能说出哪些理由？,