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1、暗视场显微镜及相差 显微镜的使用,实验目的,掌握暗视场显微镜及相差显微镜的原理、构造及使用方法 。,实验内容,一 暗视场显微镜 1 实验原理 2 结构特点 3 使用方法 4 注意事项 二 相差显微镜 1 实验原理 2 结构特点 3 使用方法 三 观察动植物细胞的胞质运动和胞质环流,一 暗视场显微镜,（一 ）实验原理 暗视野显微镜是以丁达尔效应为基础，通过特殊的聚光器，使照射样品的直射光不能进入物镜，只有被照样品表面反射或衍射的散射光进入物镜，因而在黑暗的视野中形成物体明亮的像。,图1 暗视野聚光器工作原理,（二） 结构特点,1.丁达尔效应：光通过浑浊媒质时 ,浑浊媒质所呈现的光的强烈散射现象,
2、通常称为丁达尔效应 2.暗视野照明方法 （1）暗视场光挡 （2）暗视场聚光器 抛物面聚光器 心形聚光器,（三 ）使用方法,1. 换上暗视野聚光器 2. 聚光器和载玻片之间加香柏油并贴紧（或直接用干燥系聚光器） 3. 聚光器光路合轴 4. 更换需用的高倍物镜进行镜检观察,（四）应用价值及注意事项,观察活细胞结构 ,细胞器运动等分子布朗运动 . 观察超微质点位移(0.20.004微米) 提高分辨力50倍 由于是散射光成像和实体有差别 ,仅有结构的光轮廓，不能分辨内部改造,观察原生动物的结构，细胞器，细胞质中超微质点的运动，存在方式，观察植物细胞器，细胞质运动。,（五） 镜检,二 相差显微镜,（一）
3、实验原理 相差显微镜是利用特殊的相差装置 ,通过光的衍射和干涉效应把光波通过样品的相位差变为振幅差以增大透明物体的明暗反差 ,从而可以用来观察未染色的活体组织和细胞结构的一种仪器,相位: 是指在某一时间上，光的波动所能达到的位置 . 相差: 是指相同波长的光线经过折射率不同的介质，其相位发生变化而产生的位差，相差一般不为肉眼所分辨，而相位的变化是由光程的差别造成的。 光程: 是指媒质的折射率和媒质厚度的乘积。 衍射: 光在不均一的媒质中传播，其方向发生弯曲变化，形成衍射光，此为衍射现象。衍射光和直射光比较有1/4 的相位差，振幅亦弱 。 干涉: 直射光和衍射光相遇会发生迭加现象造成振幅的变化，
4、或明或暗。,图2 光波通过不同介质时产生的相位差,图3 直射光及衍射光的产生与波动,图4 相差显微镜的光路图,（二 ） 相差显微镜的结构特 1. 用环状光阑代替可变光阑：把直射光所成的像从衍射旁像中分出来。 2. 用相差物镜(内含相板)代替普通物镜 相板结构 共轭面:环状，通过直射光 补偿面:非环状，通过衍射光 相板作用:将直射光和衍射光分别加以相位调整 及强度削弱 . 相板类型:明相差或负相差 ,暗相差或 正相差 . 3. 用中心望远镜合轴调中 4. 光源和滤色镜：强光低热和绿色滤色镜,图5 相板结构示意图,相差装置的安装 相差物镜的调换安装 转盘聚光器的调换安装 把绿色滤色镜放入镜座的滤色
5、镜架上 聚光器的调中 相板圆环与环状光阑圆 ,薄则环的合轴调中 相差物镜与环状光阑的匹配 把CT放入目镜筒 明环和暗环的聚焦 明环和暗环的调中重叠 回装观察目镜,（三） 使用方法,图6 相差聚光器及合轴望远镜,图7 光环与相板的合轴过程 a 未调整状态 b 近调整状态 c 正常态,字母 反差 应 用 P 正 观察细胞和细胞核的内部结构 N 负 观察微小的物体 ,如孢子 ,鞭毛和活的样品等 H 高 当样品反差较低时 L 低 当样品反差较高时 M 中 当样品反差为中等时,四 相差物镜的选择,图8 光的干涉及明暗相差形成的图解,（五）观察: 培养的草履虫装片及其它原生动物 鸭趾草下表皮（质点颤动） 鸭趾草雄蕊毛（胞质环流） 注意事项: 制片愈薄愈好（20微米以下） 必须加盖片，否则圆环和亮环不重合，反差不好。 玻片无伤，均匀，平整，以免亮环发生歪斜，制片厚度不超过 1.0 mm ，厚则亮环大，薄则亮环小。 如果染色必须浅，而且是淡染。,思考题,1 试述相差显微镜的成像原理及结构特点 2 简述相差显微镜的使用方法及注意事项,