《3第三次实验.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《3第三次实验.ppt（54页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、医学细胞生物学实验,林 刚,第三次实验,实验四 ABO血型鉴定 实验五、八 人血涂片的制作与观察 实验六 细胞组分的化学反应,实验四 ABO血型鉴定,实验原理 血型就是血细胞膜上特异抗原的类型。 在 ABO 血型系统中，根据红细胞膜上是否含 A 或 B 抗原将血液分为 A、B、AB、O 四种类型。 红细胞膜上抗原分 A 和 B 两种，而血清中含有与其相对应的两种抗体，即抗 A 抗体和抗 B 抗体。 当含有A抗原的红细胞与含有抗A抗体的血清相遇，或B抗原与抗B抗体相遇时，红细胞会凝集成团，即发生凝集反应。,ABO血型类型,红细胞膜上含有 A 抗原，称为A 型；而血清中含有抗 B抗体。 红细胞膜上
2、含有 B 抗原，称为 B 型；而血清中含有抗 A抗体。 红细胞膜上含有 A 和 B 抗原，称为 AB 型；而血清中无抗 A、抗 B 抗体。 红细胞膜上不含有 A、B 抗原，称为 O 型；而血清中含有抗 A 和抗 B 抗体。,如何来确定血型,血型鉴定是将受试者的红细胞悬液加入标准抗 A 血清与抗 B 血清中，观察有无凝集现象，即可确定血型。,试剂和材料,抗 A 血清、抗 B 血清、采血针 、玻片、 竹签、 棉球、记号笔 。 生理盐水、75酒精、碘酒。,实验步骤,1. 取玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用记号笔标明 A 及 B 。 2. 抗 A 血清为蓝色，抗 B 血清为黄色。 3.
3、滴一滴抗 A 血清在A侧，滴一滴抗 B 血清在 B 侧 。,实验步骤,4. 以穿刺法自左手无名指指尖或耳垂取血，采血时应注意先用 75 酒精消毒指尖或耳垂。3 根毛细管，2根采血量 0.5 ml；另 1 根 1 ml。 5. 采血后应用消毒棉块或其他消毒止血物品压紧针刺破处，不要触及脏物，不要立即浸水洗手。采血后压迫止血。 6. 在玻片的每侧各放入一小滴血，轻轻摇匀，使每侧抗血清和血液混和。 7. 静置室温下 1030 min 后，观察有无凝集现象，并据此判断血型。,实验结果判断,. 静置1030 min后观察结果。如有凝集反应可见到呈红色点状或小片状凝集块浮起。先用肉眼看有无凝集现象，肉眼不
4、易分辨时，则在低倍显微镜下观察，如有凝集反应，可见红细胞聚集成团。 . 根据被试者红细胞是否被 A 或 B 型标准血清所凝集，判断其血型。,实验结果判断,如果两侧均不凝集，则为 0 型； 只有 A 侧发生凝集反应，则为 A 型； 只有 B 侧发生凝集反应，则为 B 型； A，B 两侧均凝集，则为 AB 型。,记录观察结果,ABO血型检测的意义,输血关系最大的是 ABO 血型系统 输血时一般情况下要同型相输，否则体内存在的抗体与输入的红细胞抗原相结合会引起严重的输血反应。例如：如果 A 型血输入 B 型人体内，型血红细胞膜上的 A 抗原就会和 B 型血清中的抗 抗体发生凝集反应（抗原抗体反应），
5、使红细胞大量破坏，产生一系列综合症状，并危及生命。所以正确的鉴定血型是安全输血必不可少的前提。,作 业,1. 通过 ABO 血型检查，你是什么血型？说明理由。 2. 如何区别血液的凝集和凝固？其机理有何差别？ 3. 根据你的血型，判断你能接受何种血型并且能够给何种血型供血？ 4. O 型血人又被称为“万能供血者”，试根据 ABO 血型分型做出你对这一说法的理解。,实验五、八 人血涂片的制作及观察方法,实验原理 涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。 瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成
6、的复合染料。 美蓝（又名亚甲蓝，mehylene blue）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构，通常为氯盐，即氯化美蓝，美蓝容易氧化为一,二,三甲基硫堇等次级染料（即天青）市售美蓝中部份已被氧化为天青。伊红（又名曙红，cosin）通常为钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀，即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后，又重新解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。,实验材料与试剂,1. 器材： 医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片 、双凹片（推片） 。 2. 试剂： Wrights 染液（配制方法：Wrights 色素粉末0.1 g，溶于 60 m
7、l 甲醇）。,实验方法与步骤,采血前用70酒精棉球消毒人的指腹,实验方法与步骤,采 血,实验方法与步骤,由于第一滴血中含单核白细胞较多， 因此弃去第一滴血。,实验方法与步骤,推片：挤出第二滴血置于载玻片的右侧,实验方法与步骤,再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于 血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血 滴，使血液沿玻片端展开成线状。,实验方法与步骤,两玻片的角度以3045为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。,实验方法与步骤,血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快，则血膜愈厚，反之血涂片愈薄。 一张良好的血涂片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞要分布均匀， 血膜边缘要整齐，并留 有一定的空隙。,实
8、验方法与步骤,血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动，使血膜迅速干燥，以免血细胞皱缩。 血膜未干透，细胞尚未牢固附在玻片上，在染色过程中容易脱落，因此血膜必需充分干燥。,血涂片染色,1. 血涂片制成后，用蜡笔在血膜两侧划线，以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上，加瑞氏染液 23 滴，使覆盖整个血膜，静置 13 min。 2. 滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水，与染料混匀，续染 510 min。 3. 用清水冲去染液，直至血膜呈淡红色；待自然干燥或用吸水纸吸干后，即可置血涂片于显微镜下进行镜检。,显微镜镜检,1. 10 倍镜：观察血涂片的质量、血细胞是否凝集、是否有寄生虫。 2. 100 倍油镜：观察红
9、细胞形态，进行白细胞分类计数。,血液组成成分,血细胞的类型及形态特征,红细胞 男（4.05.5)x1012/L 女（3.55.0)x1012/L 白细胞 （4.010）109/L 中性粒细胞 50%70% 嗜酸性粒细胞 0.5%3% 嗜碱性粒细胞 0%1% 单核细胞 3%8% 淋巴细胞 25%30% 血小板 （100300)x109/L 临床上，若RBC 300万/L 和Hb 10 g/100ml，即为贫血。,红细胞,红细胞：直径7.5 m，正面看呈双凹圆盘状，侧面看呈哑铃状，中间染色浅，周围染色深，无细胞核。,血细胞的类型及形态特征,2）白细胞（ leukocyte，white blood
10、cell，WBC）,正常值：400010000/L,血小板,血小板：呈双凸的扁盘状，常伸出突起，边缘不规则，成群分布，无细胞核，中央为颗粒区，周边为透明区； 是骨髓中巨核细胞胞质脱落下来的小块。,白细胞,淋巴细胞：细胞核相对很大，细胞质极少。核内染色质多，染色较深。核圆形深染，核周围浅染，胞质蓝灰色。,白细胞,单核细胞：体积最大的白细胞。其细胞核常偏位，呈多形性，如卵圆形、肾形(a)、马蹄形(b)、不规则形（c）等，常有折叠感(c)；染色质呈疏松网状，着色较浅。,白细胞,中性粒细胞：圆形，胞质淡红色。胞核幼稚型的呈杆状或马蹄形，成熟的呈分叶状，3 叶的较多见。,白细胞,嗜酸性粒细胞：细胞呈圆形
11、，直径1315 m。胞质内充满粗大、整齐、均匀、紧密排列的砖红色或鲜红色嗜酸性颗粒。细胞核的形状与嗜中性白细胞相似，通常有23 叶，呈眼镜状，深紫色。嗜酸性粒细胞容易破碎，颗粒可分散于细胞周围。,白细胞,嗜碱性粒细胞：胞质内含粗大、大小分布不均、染成蓝紫色的嗜碱性颗粒。颗粒可覆盖在细胞核上，因之细胞核虽亦呈分叶状，但常不清楚。,血细胞的类型及形态特征,人血液涂片 （Wright 染色） 1. 红细胞 2. 中性粒细胞（杆状核） 3. 中性粒细胞（分叶核）4. 嗜酸性粒细胞 5. 嗜碱性粒细胞 6. 单核细胞 7. 淋巴细胞,血细胞分类计数及形态特征,临床意义,1）中性粒细胞（N）：具有游走性和
12、吞噬作用。增多见于：a急性感染和化脓性感染：肺炎、败血症、脓肿等。b组织损伤：大手术后、心肌梗塞、肺梗塞等。c恶性肿瘤：急、慢性白血病、淋巴瘤等。d各种中毒：尿毒症、糖尿病酸中毒等。减少见于：a某些传染病：流感、伤寒、付伤寒、麻疹。b某些血液病：再障、粒细胞缺乏症、白细胞减少症。c化疗或放疗后，抗癌药物，X线及镭照射。d其它：脾功能亢进，自身免疫性疾病，高度恶病质。,临床意义,2）嗜酸粒细胞（E）：嗜酸粒细胞与变态反应有关，并有吞噬抗原抗体复合物的作用。增多见于：a变态反应性疾病：支气管哮喘、药物过敏、荨麻疹、血管神经性水肿、过敏紫癜。b寄生虫病：蛔虫病、钩虫病、血吸虫病。c某些皮肤病：湿疹、
13、牛皮癣、剥脱性皮炎等。d某些血液病：慢粒、恶性淋巴瘤、嗜酸性粒细胞性白血症、多发性骨髓瘤、何杰金氏病等。减少见于：a应用糖皮质激素、促肾上腺皮质激素。b伤寒、副伤寒等病患者。,临床意义,3）嗜碱性粒细胞（B）：嗜碱性粒细胞主要参与特殊的免疫反应。增多见于：a慢性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病。b某些转移癌及骨髓纤维化。嗜碱粒细胞减少无临床意义。,临床意义,4）淋巴细胞（L）：淋巴细胞能产生和运载抗体，在防御病毒感染方面有重要作用。增多见于：a某些病毒或细胞所致的传染病：传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、传染病恢复期、结核病、百日咳。b淋巴细胞性白血病、白血性淋巴肉瘤。减少见于：a应
14、用肾上腺皮质激素、接触放射线。b细胞免疫缺陷病、某些传染病的急性期。,临床意义,5）单核细胞（M）：单核细胞具有游走性和吞噬作用，除吞噬细胞和异物外，又能吞噬原虫及具有类脂质包膜的结核杆菌及麻风杆菌。增多见于：a某些感染：伤寒、结核、疟疾、黑热病、亚急性细菌性心内膜炎。b某些血液病：单核细胞性白血病、淋巴瘤、骨髓异常增殖综合症、恶性组织细胞病。减少一般无临床意义。,作业：屏幕截取红细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板的图片，并标注图片名称放大倍数。,实验六 细胞组分的化学反应,实验内容：DNA 和 RNA 的显示 目的要求 熟悉细胞 DNA 和 RNA 的分
15、布状况，了解细胞核染色的一般原理和方法及其意义； 掌握高尔基体和线粒体的形态及分布状况，了解高尔基体和线粒体染色原理及方法。,实验原理,1. 甲基绿-派洛宁混合染液处理细胞后，可使细胞内 DNA 和RNA 显示不同的颜色。 2. 用核酸水解酶（DNase 和 RNase）作为“酶水解对照”研究证实：甲基绿所染者为 DNA，可被脱氧核糖核酸酶 （DNase） 消化而特异性失染。派洛宁所着色者为 RNA，可经核糖核酸酶（RNase）消化使原派洛宁阳性物质失染。因而甲基绿派洛宁染色成为一种显示核糖核酸的组织化学方法。,3. 甲基绿染 DNA 和派洛宁染 RNA 不是化学作用，而是这两种染料与 DNA
16、 和 RNA 聚合程度不同，也就是说 DNA 和 RNA 对这两种碱性染料有不同的亲和力，所以是选择性染色； 4. DNA 分子为高聚分子，甲基绿分子有两个相对的正电荷。甲基绿对聚合程度高的 DNA 分子有强的亲和力，使 DNA 染成绿色； 5. RNA 为低聚分子，派洛宁有一个正电荷。派洛宁仅与聚合程度低的RNA 结合，使 RNA 染成红色。,实验原理,实验材料和试剂,材料：鸡血（蛙血） 仪器：光学显微镜，载玻片，镊子等 试剂：Unna 染色液（甲基绿-哌洛宁G） 溶液A： 5% 哌洛宁G 水溶液 17.5 mL 2% 甲基绿水溶液 10 mL 蒸馏水 250 mL 溶液 B：0.2 mol
17、/L pH为 4.8 的醋酸盐缓冲液（配法：先将1.2 mL 醋酸液用水定容至 100 mL，再将2.7 g 醋酸钠溶解后用水定容至100 mL，然后将醋酸和醋酸钠两液按 77 mL 和 100 mL 的比例混合）。 在应用前，把 A 液和 B 液按等量混合，混合液可以保存一周时间，时间长染色效果不佳。,实验步骤,涂片：取一滴鸡血置于玻片的一端，一手持玻片，另一只手再拿一边缘平滑的玻片，将一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后使推片与载片夹角保持 3045平稳地向前移动，载玻片上保留下一薄层血膜； 固定：将晾干的血涂片浸入70% 乙醇中，固定 510 min，取出后室温晾干； 染色
18、：把血涂片平放在实验台上，加 23 滴甲基绿-派洛宁混合染液于血涂片上，将染液铺平，染色 1520 min； 水冲洗：用细流水冲洗血涂片数秒钟，然后将玻片立于吸水纸上，吸去多余的水分； 观察：盖上盖玻片在显微镜下观察，细胞核、细胞质各被染成什么颜色？,涂片操作方法,一张良好的血涂片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞要分布均匀，血膜边缘要整齐，并留有一定的空隙。 血滴愈大，角度愈大，推片速度愉快，则血膜愈厚，反之血涂片愈薄。,注意事项,血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动 , 使血膜迅速干燥 , 以免血细胞皱缩。 血膜未干透 , 细胞尚未牢固附在玻片上 , 在染色过程中容易脱落 , 因此血膜必需充分干燥。,观察染色效果,医学中的应用,1. 分析核酸内部的结构，分子的结构及含核酸的细胞成分构相。 2. 单链或双链 DNA/RNA 定性和定量分析，对肿瘤的诊断、分类及预后判断有重要意义。 RNA主要存在于胞质及核仁内，它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生，胞质蛋白质合成亢进时，核仁和胞质的 RNA 增加。 恶性瘤细胞核仁巨大，胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白，胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此，这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱，是蛋白质合成增强的标志。 注意事项：核酸染料都是强诱变剂，请大家注意保护。,作业：屏幕截取图片，并标注图片名称放大倍数。,结束！,