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1、课题2、3微生物的分离与计数,2019/6/25,高中生物选修1 专题2 微生物培养与应用,主要 内容,2019/6/25,大肠杆菌的纯化培养； 分解尿素的细菌的计数; 分解纤维素微生物的分离。,大肠杆菌的纯化培养,大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板：,培养基、培养皿,分散成单个细胞,形成单个菌落,大肠杆菌的纯化培养,倒平板,约
2、50,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基,大肠杆菌的纯化培养,大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌：,平板划线法：,菌种,划3个平板,1个不划线,1.接种：,接种环,防止划破培养基,（重复实验）,（空白对照）,大肠杆菌的纯化培养,平板划线法,大肠杆菌的纯化培养,问题讨论,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物,杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增
3、加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,大肠杆菌的纯化培养,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,102,103,104,105,106,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,大肠杆菌的纯化培养,大肠杆菌的纯化培养,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,试,涂,大肠杆菌的纯化培养,平板划线法：,稀释涂布平板法：,2.培养：,将接种后的培养基和一个未接种的培养基,放入37恒温箱中培养12h24h后，,观察并记录,大肠
4、杆菌的纯化培养,菌种的保藏：,1.临时保藏：,试管固体斜面培养基上,4,2.长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml甘油1ml菌液,20,大肠杆菌的纯化培养,复习,分解尿素的细菌的计数,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,分离产生脲酶的细菌,分解尿素的细菌的计数,筛选菌株 提出的问题 如何寻找耐高温的酶？ 解决问题的思路 寻找耐高温环境； 原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌， 耐高温菌种提取耐高温酶。,分解尿素的细菌的计数,筛选菌株 选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止
5、其他种类微生物生长的培养基。,分解尿素的细菌的计数,筛选菌株 KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,?,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生存。,分解尿素的细菌的计数,统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板） （1）操作方法： 稀释涂布平板统计菌落数 （2）原理： 1个菌落1个活菌 （3）统计原则 选
6、 30300 个菌落的平板统计 每个稀释度取3个平板取其平均值,为什么？,分解尿素的细菌的计数,统计菌落数目 1、活菌计数法 （4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。,为什么？,分解尿素的细菌的计数,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别
7、为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,分解尿素的细菌的计数,2、显微观察法：比例计数或直接计数（血球计数板）,计数室（中央大方格）的长、宽和高分别为： 1 mm 、1 mm和 0.1mm 计数室的容积：0.1mm3 （万分之一毫升） 取样：稀释一定倍数的菌液,分解尿素的细菌的计数,分解尿素的细菌的计数,酵母细胞数/ml80小格内酵母细胞个数/80400104稀释倍数,计数顺序： 左上右上右下左下 压在格线的，只统计左线
8、和上线,3.称重法：,一个细胞（细菌）一般重约10121013g,分解尿素的细菌的计数,4.比浊法记数,当细菌浓度达到107个/ml时,培养基会浑浊,利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。,设置对照同等条件下，培养空白培养基,?,分解尿素的细菌的计数,设
9、置对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。,分解尿素的细菌的计数,尿素培养基,未接种的尿素培养基,10-5,10-4,分解尿素的细菌的计数,实验过程,（一）土壤取样 1、取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中7090是细菌。在富含有机质的土壤层的38cm处中分布着绝大多数的细菌。 2、取样要求：铲去表层土。,分解尿素的细菌的计数,（二）样品稀释 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌
10、：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 原则：确保平板上的菌落数在30300之间。 （三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细菌：3037，12d; 放线菌:2528, 57d; 霉菌: 2528, 34d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象,分解尿素的细菌的计数,分解尿素的细菌的计数,（四）鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌 原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,分解尿素的细菌的计数,复习,分解纤维素微生物的分离,纤维
11、素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、 CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,分解纤维素微生物的分离,背景知识,滤纸崩溃法,纤维素酶活性的测定实验：,分解纤维素微生物的分离,背景知识,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,分解纤维素微生物的分离,背景知识,实验流程示意图,实验设计,分解纤维素微生物的分离,一、实验目的,1、利用特定的选择培养基和鉴别培养基从土壤中分离分解纤维素的微生物。,2、掌握刚果红染色的
12、机理和操作。,分解纤维素微生物的分离,实验设计,1、以纤维素为碳源的选择培养基能选择出分解纤维素的微生物。,2、刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,二、实验原理,分解纤维素微生物的分离,实验设计,三、所需仪器、材料、用具和药品,1、实验仪器与用具,除了分离分解尿素的细菌中用到的有关仪器用具外，还需要恒温振荡培养箱。,2、材料与药品,分解纤维素微生物的分离,实验设计,四、实验的方法和步骤,1、配制培养基,2、灭菌,3、土壤取样,5、样品稀释,6、涂布接种,4、选择培养,7、筛选菌落,分解纤维素微生物的分离,实验设计,配制培养基,分解纤维
13、素微生物的分离,实验设计,灭菌,酵母膏：实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是国家行业标准的规定名称。酵母抽提物以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。,水解酪素：微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。酪蛋白水解后富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全。因此常用于制备培养基。,CMC-Na：羧甲基纤维素钠，是天然纤维素经化学改性后得到的纤维素衍生物，是纤维素的羧甲基醚化物。,分解纤维素微生物的分离,实验设计,思考： 1.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 2.将滤纸埋在土壤中有什么
14、作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,土壤取样,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。,分解纤维素微生物的分离,实验设计,“浓缩”作用,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1-2d，直至培养液变混浊。 吸取一定量的培养液，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变混浊。,（富集培养）,选择培养,根据样品中目的菌株数量来确定是否需要。,分解纤维素微生物的分离,实验设计,样品稀释,分解纤维素微生物的分离,实验设计,涂布接种,鉴别纤维素分解菌的培养基
15、,挑选产生透明圈的菌落。挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C370C培养，可获得纯培养。,筛选菌落,分解纤维素微生物的分离,实验设计,刚果红染色法,方法一： 先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。,方法二： 在倒平板时就加入刚果红。,分解纤维素微生物的分离,实验设计,复习,微生物培养的基本程序,培养基的配制称量溶化调pH分装包扎,总结,（2013新课标卷II）临床试用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题： （1）为了从
16、样本中获取致病菌菌落，可用_法或_法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。 （2）取该单菌落适当稀释，用_法接种于固体培养基表面，在37培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。,【答案】：（1）划线 稀释涂布（或涂布）（2）涂布,（3）为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A，B，C，D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B_；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明_；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落
17、，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的_。 （4）根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选择抗生素_。,（3）敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比对A弱 耐药菌 （4）A,（2013上海卷）回答下列关于微生物的问题。阿拉伯胶是一种多糖，研究者从某地合欢树下距离地表深1015cm处的土样中初筛到能合成阿拉伯胶降解酶的菌株SM01，以下为该菌株的鉴定过程。 41为获得单菌落，可采用_法将初筛菌液接种在_培养基上。 42SM01的菌落为粉白色，菌落初期呈突起絮状，在显微镜下观察到，菌丝白色致密，且有分生孢子，细胞核直径约1m，初步推测为真菌，则其特征中，最能说明SM01是真菌的是_。
18、A菌落初期呈突起絮状 B菌落粉白色 C有菌丝，白色致密 D有细胞核，且有分生孢子 43SM01还一定具有的结构有_（多选）。 A细胞膜 B核糖体 C拟核 D荚膜 E芽孢 F菌盖,41.划线法/涂布法 固体 42.D 43.A、B,44表4中培养液pH均为6.0，若对SM01中阿拉伯胶降解酶的活力进行测定，则应选用表中的_培养液，针对不选用的其他培养液，分别说明原因： （1）_； （2）_；（3）_。,44.D （1）A培养液缺少氮源，SM01不能很好生长（2）B培养液缺少氮源，SM01不能很好生长；且有阿拉伯胶酶，会影响对SM01自身产生的酶活力的测定结果（3）C培养液缺乏阿拉伯胶酶催化底物阿拉伯胶，会影响SM01的生长，也无法对阿拉伯胶酶活力进行测定,本节课内容结束,