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1、1/46,第5讲 发酵工程在环境污染治理中的应用,2/46,1 发酵工程概述,发酵工程是现代生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节 发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，又称微生物工程 发酵是指利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其他代谢产物的过程，目前也扩展为培养生物细胞（动植物细胞和微生物细胞）来制得产物的所有过程,3/46,发酵工业回顾,几千年前，人类开始酿酒、制酱、制奶酪等 1675年，列文虎克发明了显微镜，观察到了微生物 巴斯德证明酒精发酵是由于酵母菌引起的，发酵现象
2、是由微生物所进行的化学反应 柯赫建立了单种微生物的分离和纯培养技术，新的发酵产品不断出现，以固态发酵和浅层液态发酵为主 上世纪40年代，抗生素大规模深层发酵工艺建立 随着新型发酵设备、发酵工艺和育种技术的发展，现代发酵工程达到了一个新的高度,4/46,微生物发酵的历史,5/46,发酵工程的内容,发酵工程由三部分组成：上游工程、发酵工程和下游工程 上游工程包括优良菌种的选育、最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定、营养物的准备等 发酵工程主要指在最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。要求严格的无菌生长环境。可分为分批发酵，补料分批发酵和连续发酵 下游工程指从发
3、酵液中分离和纯化产品的技术。包括固液分离技术，细胞破壁技术，蛋白质纯化技术，和产品的包装处理技术。还要考虑发酵后的菌体与废物处理问题,6/46,发酵工程的优点,生物工程真正能应用于工业化生产的，主要是发酵工程。基因工程，细胞工程，酶工程等往往也需要通过微生物才能转化为生产力 以生物为对象，不完全依赖有限资源，可再生 反应温度较低，生产可连续化，成本低 安全有效，所得生物产品价格低廉、纯净 能解决传统化学工业技术的一些难题 可定向创造新品种、新物种 投资小，收益大，见效快,7/46,发酵工程的应用,现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用,发酵法生产的物质,8/4
4、6,发酵的基本过程,9/46,菌种选育,发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工艺和设备 菌种选育的目的是为了改良菌种的特性，使其符合工业生产的需要 提高其生产能力 能适应特定的工艺条件，如能利用廉价的原料、耐受性好 目前主要采用自然选育和诱变育种的方法，工作量大，有一定盲目性 基因工程、细胞工程等育种方法具有定向性,10/46,菌种分离、筛选的原则与步骤,菌种分离过程中需要考虑的主要因素 营养特性，能够利用廉价、来源丰富的原料 生长温度 遗传和生产能力的稳定性 转化能力和产物浓度高 易分离，本身无毒，也不产毒 筛选菌种的具体步骤可分为：采样、富集与分离、发酵与性能测定等,11/46
5、,菌种分离纯化及筛选步骤,12/46,自然选育,不经过人工诱变，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育 变异的实质是DNA序列的变化 自然突变的原因 宇宙射线、短波辐射、诱变物质等 碱基的互变异构作用，造成配对错误 自然突变的几率大约是10-910-8 自然突变可能导致菌种退化或对生产有益的转化 效率较低，容易退化,13/46,诱变育种,诱变育种是诱发突变与随机筛选相结合的一种育种技术，是工业微生物育种中使用最多的菌种改良手段 人为利用物理、化学因素，使诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA的某一部位发生改变（点突变），从而使微生物的遗传
6、物质DNA或RNA的化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异 诱发突变的频率远大于自然突变,14/46,常用的诱变剂及其类型,15/46,常用烷化剂的种类,16/46,诱变育种方案设计,诱变育种的环节 突变的诱发 突变株的筛选 突变高产基因的表现 制定筛选目标要考虑高产性状和其他有利性状 制定筛选方案综合考虑出发菌株和诱变剂的选择，并选择合适的诱变方法和剂量,17/46,微生物诱变育种流程,18/46,诱变育种的筛选,19/46,初级代谢产物和次级代谢产物的比较,20/46,补料分批发酵的优势,解除营养基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应 对于好氧发酵，避免在分批发酵中因一次性投入基质过
7、多而造成细胞大量生长，好氧过多，以致通风搅拌设备不匹配的状况 某些情况下，还可以减少菌体生产量，提高产物的转化率 与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题，其适用范围也比连续发酵广 加入物质和如何添加仍然需要经验确定，有盲目性,21/46,连续发酵的优点,操作条件的稳定有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定 机械化和自动化能降低劳动强度 减少非生产占用时间，提高设备利用率 细胞生长状态一致，产物生产的持续性好 生产同样量产物所需生物反应器比分批发酵的小 测量仪器探头寿命延长 过程优化容易，有效提高发酵效率,22/46,连续发酵的缺点,对设备、仪器及控制元器件的要求较高，
8、投资成本高 开发系统，发酵周期长，易染菌 长期连续发酵，微生物易变异 粘性丝状菌菌体容易附着和结团，给操作带来困难 长时间维持工业规模生产的无菌状态较为困难 连续发酵主要应用于理论研究，如发酵动力学参数的测定，过程条件的优化等 已应用于工业生产的有单细胞蛋白生产、废水生物处理等 固定化细胞技术与连续培养相结合，已应用于丙酮、丁酸、异丙醇等重要工业溶剂,23/46,发酵生物反应器,发酵罐是最重要的微生物细胞反应器 染菌率低 大型化，有利于提高经济效益 过程优化可提高产量和降低成本 利于提高产品回收率和质量 生物反应器的基本类型 搅拌式生物反应器（stirred tank reactor） 鼓泡塔
9、式反应器（bubble column） 气升式反应器（airlift reactor）,24/46,几种常见的生物反应器,25/46,发酵罐的结构,26/46,发酵过程监测,物理参数 温度、压力、流量、转速、粘度、泡沫位等 化学参数 pH、溶氧、尾气、发酵液成分、离子浓度等 生物参数 生物量、ATP、蛋白质等 在线与非在线测量 间接测量,27/46,发酵动力学,细胞生长和死亡动力学 基质消耗动力学 氧消耗动力学 CO2生成动力学 产物合成和降解动力学 代谢热生成动力学,28/46,微生物生长动力学,微生物分批培养生长曲线,29/46,Monod方程,对数期微生物增长： Monod方程： 双基质
10、限制生长动力学： 基质抑制生长动力学：,30/46,细胞死亡动力学,31/46,产物形成动力学,L-P模型： K10, K2=0时，为生长耦联型 K10, K20时，为部分生长耦联型或混合型 K1=0, K20时，为非生长耦联型,32/46,发酵过程优化及控制,建立发酵过程模型，实现过程优化控制,描述细胞群体的数学模型,33/46,非结构模型,发酵过程参数之间的关系,34/46,发酵过程控制,35/46,下游处理流程,36/46,发酵与产物分离耦联技术,在反应过程中及时将产物或有害物质从反应系统中移出，可以保证生化反应高效进行，简化下游处理 真空发酵：真空减压，易挥发组分分离，只适用于厌氧发酵
11、 气提发酵：氮气、氢气或二氧化碳作为气提载体，将发酵蒸气压大于水的挥发性产物带出，主要用于厌氧发酵 吸附发酵：吸附剂回收产物或副产物，减少抑制 膜分离发酵：膜分离设备与发酵设备耦联，膜生物反应器 萃取发酵：双水相萃取,37/46,代谢控制发酵,利用遗传学的方法或其他生物化学方法，人为的在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使有用目的产物大量生成和积累,微生物细胞氨基酸、核苷酸的调节机制,38/46,酶的生物合成和活性调控,39/46,代谢控制发酵的设计思路,改变代谢流 加快速度限制反应 改变分支代谢途径流向 构建代谢旁路 改变能量代谢途径 扩展代谢途径 转移或构建新的代谢途径,40/46,
12、2 发酵工程在环境污染治理中的应用,废水生物处理装置实际上可以看作一个大型发酵罐，有机污染物在微生物作用下，转化成CO2和水 废水生物处理技术具体见第6讲 固体废物的堆肥，垃圾的填埋以及废物资源化过程均为发酵过程 固体废弃物生物处理技术具体见第8讲 废物资源化具体见第13讲,41/46,固态发酵,又称固体发酵，是指微生物在没有或几乎没有游离水的固体的湿培养基上生长、繁殖、代谢的发酵过程,固态发酵的优缺点,42/46,固态发酵生物反应器类型,浅盘式生物反应器 填充床生物反应器 流化床生物反应器 转鼓式生物反应器 搅拌生物反应器,43/46,浅盘生物反应器,44/46,水平桨混合反应器,45/46,堆肥,依靠自然界广泛分布的细菌、真菌等微生物，有控制的促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学过程 好氧堆肥：发热阶段（中温微生物），高温阶段（好热纤维素分解菌），降温和腐熟保肥阶段（中温微生物）；预处理，一次发酵、二次发酵，后处理 厌氧堆肥：不设通气系统，温度低，腐熟及无害化所需时间较长,46/46,污泥堆肥中的微生物相,