7原核生物基因表达调控.ppt

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1、2019/6/25,1,7 基因的表达与调控（上） 原核基因表达调控模式,2019/6/25,2,2019/6/25,3,7.1 原核基因表达调控总论,基因表达（gene expression） ：指基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子或RNA产物的过程。 对这个过程的调节称为基因表达调控（gene regulation 或 gene control） 组成型基因 (constitutive genes) 调控型基因 (regulated genes),2019/6/25,4,组成型基因(constitutive genes),又称管家基因(housekeeping gene

2、s) 是维持细胞生存必需的一类基因，在各类细胞中都处于活性状态。 管家基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因表达只受启动程序或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其它机制的调节。管家基因的表达水平不同，但无论水平高低，它们都较少受环境变化的影响，而且在个体各个不同的生长阶段几乎全部组织中持续表达，或变化很少。 由于:（1）启动子的天然效率，靠它制造mRNA；（2）核糖体阅读信使的速度；（3）其信使被核酸酶降解的敏感性（mRNA的寿命）。,2019/6/25,5,调控型基因(regulated genes),又称奢侈基因(luxury genes) 在不同组织细胞中选择表达的

3、基因。根据细胞生长、发育的需要或环境因素的改变，其活性受到调控。,2019/6/25,6,2019/6/25,7,基因表达调控主要表现在以下两个方面： 转录水平上的调控(transcriptional regulation)； 转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation），包括 mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript)； 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。,2019/6/25,8,指挥基因调控的信号,原核生物：营养状况、环境因素

4、真核生物：激素水平、发育阶段,2019/6/25,9,基因表达调控的时间性和空间性,2019/6/25,10,7.1.1 原核基因调控分类,原核生物的基因调控主要是转录调控，包括负转录调控和正转录调控。 正调控（positive control）： 在操纵子中，结构基因本来不表达，可当调节蛋白（无辅基诱导蛋白）出现时，使该结构基因进行表达。这样的调控叫正调控。 负调控（negative control）：在操纵子中，结构基因本来是表达的，当调节蛋白（阻遏蛋白）出现时，使该结构基因不表达。这样的调控叫负调控。,2019/6/25,11,在正调控中，反式作用因子必须结合在顺式作用元件上以促进RNA

5、聚合酶在启动子位置起始转录。,2019/6/25,12,在负调控系统中，阻遏物结合在顺式作用元件上以阻止转录。,2019/6/25,13,顺式作用元件（cis-acting element）：DNA元件是指DNA上的一段序列，它只能作用于同一条DNA，故称为顺式作用元件。 结构基因（structural gene）：编码RNA或蛋白产物的基因，如酶和结构蛋白的基因，叫结构基因。,2019/6/25,14,调节基因（regulatory gene）：编码的产物能够调节其他基因的表达，这样的基因叫调节基因。 调节蛋白（regulatory protein）：调节基因的表达产物，叫调节蛋白。包括正调

6、节蛋白，又叫激活蛋白（activator）；负调节蛋白，又叫阻遏蛋白(repressor)。 由于调节蛋白（RNA）能够自由地与其相应的结合位点结合，故又称为反式作用因子（trans-acting element）。,2019/6/25,15,负调控,根据作用特征,负控诱导,负控阻遏,正调控,根据作用特征,正控诱导,正控阻遏,2019/6/25,16,细菌中的转录调控体系。 a. 负控诱导系统； b. 正控诱导系统； c. 负控阻遏系统； d. 正控阻遏系统。,2019/6/25,17,7.1.2 原核基因调控的主要特点,可诱导的调控：在可诱导的操纵子中，加入对基因表达有调节作用的小分子物质（

7、诱导物），则开启基因的转录活性。 可阻遏的调控：在可阻遏的操纵子中，加入 对基因表达有调节作用的小分子物质（辅阻遏物），则关闭基因的转录活性。,2019/6/25,18,7.2 操纵子学说（theory of operon）,1940年， Monod发现：E.coli在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时， 细菌先利用葡萄糖，葡萄糖耗尽后，才利用乳糖； 在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿，即产生“二次生长曲线”。,2019/6/25,19,乳糖对半乳糖苷酶的合成有诱导作用。 葡萄糖对半乳糖苷酶的合成有抑制作用。,2019/6/25,20,由法国科学家Jacob和Monod于1960年提出的一个有关原

8、核基因表达调控的模型操纵子模型。获得1965年诺贝尔生理学奖。,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1965. “for their discoveries concerning genetic control of enzyme “,2019/6/25,21,1. 基本概念(Key terms defined in this section),操纵子（operon）： 原核生物中几个功能相关的结构基因成簇串联排列组成的一个基因表达的协同单位（DNA序列）。 一个操纵子编码序列（2-6）+ 启动序列 + 操纵序列 + (其他调节序列),2019/

9、6/25,22,2019/6/25,23,2019/6/25,24,2. 乳糖操纵子,（1）乳糖操纵子（lactose opron） 结构 大肠杆菌乳糖操纵子是一种可诱导的负调控系统。 大肠杆菌乳糖操纵子（lactose operon）包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。,2019/6/25,25,乳糖操纵子（lactose opron） 结构,I,P,O,Z,Y,A,调控基因 控制位点 结构基因,DNA,阻遏蛋白,启动序列,cAMP-CAP结合位点,操纵序列,半乳糖苷酶,通透酶,乙酰基转移酶,RNA聚合酶 结合位点,（6759）,（

10、728）,2019/6/25,26,2019/6/25,27,Z-半乳糖苷酶；Y-半乳糖苷透过酶；A-半乳糖苷乙酰基转移酶。 -半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。 -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 -半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,操纵基因的鉴定（foot-printing ）,1）P-O区,Footprinting identifies DNA-binding sites for proteins

11、 by their protection against nicking.,2019/6/25,29,内切酶,SDS-PAGE SDS-PAGE,2019/6/25,30,操纵基因的结构,The lac operator has a symmetrical sequence. The sequence is numbered relative to the startpoint for transcription at +1. The regions of dyad symmetry are indicated by the shaded blocks.,2019/6/25,31,操纵基因的位

12、置,2019/6/25,32,Operators may lie at various positions relative to the promoter.,2019/6/25,33,Figure 9.10 RNA polymerase initially contacts the region from -55 to +20. When sigma dissociates,the core enzyme contracts to -30; when the enzyme moves a few base pairs, it becomes more compactly organized

13、into the general elongation complex.,2019/6/25,34,Promotor: -84-+ 1 Operator: -7-+28 两者有7bp重叠，使这段序列可能无法同时结合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能虽然可以同时结合，但无法形成开放的转录起始复合物。,2019/6/25,35,2019/6/25,36,2）Lac阻遏物的作用-负调控,调节蛋白的基本结构,2019/6/25,37,Figure 10.14 The crystal(晶体) structure of the core region of Lac repressor identifies t

14、he interactions between monomers in the tetramer. Each monomer is identified by a different color.,2019/6/25,38,Figure 10.15 Inducer changes the structure of the core so that the headpieces of a repressor dimer are no longer in an orientation that permits binding to DNA.,2019/6/25,39,2019/6/25,40,20

15、19/6/25,41,2）Lac阻遏物的作用-负调控,2019/6/25,42,Lac阻遏物的作用-负调控,没有乳糖存在时,2019/6/25,43,有乳糖存在时,2019/6/25,44,2019/6/25,45,2019/6/25,46,安慰诱导物 gratuitous inducer：能高效诱导酶的合成但不被所诱导的酶分解的分子。 如：IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）,2019/6/25,47,3、乳糖操纵子学说（Lac Operon Theory）,一个或几个结构基因与一个调节基因和一个操纵基因组成 一个操纵子。调节基因编码调节蛋白，调节蛋白与操纵基因结 合，从而调控结构基因的表达。 乳

16、糖为诱导物。当有乳糖存在时，乳糖与有活性的调节蛋 白（阻遏物）结合时，阻遏物失活，则不能与操纵基因结合， 解除对-半乳糖苷酶基因（结构基因）的抑制，开始表达。 如果去掉乳糖时，阻遏物又恢复其活力，与操纵基因DNA 结合，将三个结构基因关闭。 但这种关闭或开启并不是100%！,2019/6/25,48,4、CAP-cAMP复合物在乳糖操纵子表达中的作用 乳糖操纵子的正调控,2019/6/25,50,某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lacmRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称

17、之为代谢物阻遏效应（cataboliterepression）。 1965年， Sutherland 发现大肠杆菌培养液中葡萄糖的含量总是与cAMP含量成反比。 1968年，发现大肠杆菌培养液中加入cAMP可增加半乳糖苷酶的产量。,2019/6/25,51,cAMP与代谢物激活蛋白,cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。 将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。,2019/6/25,52,2019/6/25,53,大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由

18、Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。,2019/6/25,54,CAP的作用机制,cAMP-CAP通过与RNA聚合酶亚基CTD相互作用，促进RNA聚合酶同启动子的结合。 cAMP-CAP结合DNA后，使其弯曲。使RNA聚合酶结合更紧密，也促进了cAMP-CAP同RNA聚合酶的结合，有利于形成开放型起始复合物，促进转录起始。,2019/6/25,55,CAP-cAMP激活作用的模型,2019/6/25,56,促进RNA聚合酶对-35和

19、-10序列的识别和结合，有利于形成开放型起始复合物,2019/6/25,57,2019/6/25,58,2019/6/25,59,lac操纵子正负调控的协调作用,两种调控机制根据存在的C源性质和水平协调的调节lac操纵子的表达。,2019/6/25,60,无乳糖:阻遏蛋白结合于操纵基因，转录不能起始。,有乳糖:阻遏蛋白失活，转录起始。 有葡萄糖:cAMP，CAP失活，不能激活基因转录， lac操纵子本底水平转录。,有乳糖:阻遏蛋白失活，转录起始。 无葡萄糖:CAP活化，激活基因转录， lac操纵子高水平转录。,2019/6/25,61,7.3 色氨酸（Trp）操纵子与负控阻遏系统,色氨酸合成步

20、骤 trpE&trpG邻氨基苯甲酸合酶； trpD邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶； trpF异构酶； trpC吲哚甘油磷酸合酶； trpA、trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。,2019/6/25,62,2019/6/25,63,Trp操纵子是合成代谢途径中最具代表性的例子。它控制着5个结构基因（编码3种酶）的表达，分别为trpE，D（邻氨基苯甲酸合成酶），C（吲哚甘油硼酸合成酶），B、A （色氨酸合成酶B链和A链）。当色氨酸低或缺乏时，这5个邻近的基因才开始转录成mRNA。,1. 结构与功能,Figure 10.41 trp操纵子包含5个相邻的结构基因，这五个结构基因上游是前导序列、操纵基因、

21、启动子序列和衰减子 。,2019/6/25,65,结构特点：,（1）阻遏物基因trpR 和结构基因trpEDCBA 不紧密连锁； （2）操纵基因在启动子区域内； （3）启动子、操纵基因不直接和结构基因毗邻，而和前导序列直接相连； （4）有衰减子结构。在合成代谢的操纵子的前导区内，存在着类似终止子结构的一段DNA序列，该序列可以辅助阻遏作用，进行转录调控，故称为衰减子（attenuator）。 由于Trp操纵子是一个合成体系，与糖的分解代谢无关，所以，与Glu的存在与否没有关系，也就不存在cAMP-CAP结合位点。,2. 调控方式可阻遏的负调控,A:,B:,无活性,Trp,RNA pol,3.衰

22、减作用,经测序后发现，在第一个结构基因（trpE）的5-端有一个长160bp的前导序列（leader sequence）。当此序列缺失130160bp时，mRNA总是最高水平的（6-10倍）。而当trp存在时，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。,前导肽（Leader peptide）：推测前导区mRNA可编码14个氨基酸组成的多肽，其中第10和第11位均为色氨酸。 有四个富含GC的区段，相邻的区段之间可形成茎环结构。,2019/6/25,69,弱化子（ attenuat

23、or ）： 一段位于结构基因上游前导区，具有终止子结构的短序列，通过前导序列转录产生的 mRNA 形成类似于终止子的二级结构，达到转录终止的目的。,2019/6/25,70,表. 衰减子控制的氨基酸合成的操纵子中前导肽的氨基酸序列 操纵子 前导肽的氨基酸序列 色氨酸 MetLysAlaIlePheValLysGlyTrpTrpArgThrSer 苏氨酸 MetLysArgIleSerThrThrIleThrThrThrIleThrIleThrThrGlyAsnGlyAlaGly 组氨酸 MetThrArgValGlnPheLysHisHisHisHisHisHisHisProAsp 异亮氨酸

24、MetThrAlaLeuLeuArgValIleSerLeuValValIleSerValValVaLIle 缬氨酸GEDA IleIleProProCysGlyAlaAlaLeuGlyArgGlyLysAla 亮氨酸 MetSerHisIleValArgPheThrGlyLeuLeuLeuLeuAsnAlaPheIleVei ArgGlyArgProValGlyGlyIleGlnHis 苯丙氨酸 MetLysHisIleProPhePhePheAlaPhePhePheThrPhePro 异亮氨酸-缬氨酸B MetThrThrSerMetLeuAsnAlaLysLeuLeuProThrAlaP

25、roSerAla AlaValValValValArgValValValVaLValGlyAsnAlaPro,2019/6/25,71,2019/6/25,72,2019/6/25,73,高Trp时： Trp-tRNATrp 存在 核糖体通过片段1(2个Trp密码子) 封闭片段2 片段3，4形成发夹结构 类似于不依赖因子的转录终止序列 RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物,转录、翻译偶联,产生前导肽,2019/6/25,74,低Trp时： Trp-tRNATrp 没有供应 核糖体翻译停止在片段1 （2个Trp密码子） 片段2，3 形成发夹结构 转录不终止 RNA聚合酶继续转录,2019/6

26、/25,75,2019/6/25,76,衰减子调控系统的生物学意义：,（1）活性阻遏物与非活性阻遏物之间的转换可能较慢，而tRNA的荷载与否可能更快捷； （2）氨基酸的主要用途是合成蛋白质，所以，以tRNA的荷载情况为标准来进行调控可能更为合适； （3）阻遏蛋白与衰减子共同作用，提高了效率，避免了氨基酸的浪费。当细胞内氨基酸高于某一水平时，可完全实现阻遏；而低于该水平时，则启用衰减子进行微细调控。 某些氨基酸操纵子仅使用衰减子即可实现调控。,2019/6/25,77,7.4 阿拉伯糖操纵子（Arabinose Operon）,阿拉伯糖操纵子是调控阿拉伯糖分解代谢所需酶系的操纵子。它具有正调控和

27、负调控的功能。 参与阿拉伯糖分解代谢的酶系共由三个操纵子编码，这三个操纵子分别是：araBAD、araE和araF。它们由一个共同的araC 调节基因进行调控。 （1）araBAD：包括三个基因：araB、araA和araD。分别编码L-核酮糖激酶、L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-表面异构酶。 （2）araE和araF：编码膜结合蛋白，与阿拉伯糖的结合与转运有关。,2019/6/25,78,1. 结构与功能,C蛋白,mRNA,mRNA,阿拉伯糖,核酮糖,核酮糖 -5-P,木酮糖 -5-P,2019/6/25,79,（1）C蛋白具有双功能：它单独与araO1(-100-144bp)

28、结合，起阻遏作用，包括其自身的表达；C与阿拉伯糖结合形成 Cind复合物，即诱导型C蛋白。它结合在araI 区(-40-78bp)，使RNA聚合酶结合于PBAD 位点（+40bp），转录B、A和D三个基因。 （2） C蛋白的两种状态：Cind和Crep ，功能不同，结合的位点也不同。前者结合于araI，后者结合于araO1和araO2。 （3） C蛋白还可以调节分散的基因： araE和araF。 So named Regulon。 （4）有两个启动子：PC和PBAD 。 PC启动子与araO1 重叠。,2019/6/25,80,2. 调控方式,（1）当存在Ara和Glu时，araC转录少量C蛋

29、白并与araO1 结合，反馈性抑制araC的转录。 （2）当有Ara而无Glu时，Ara可作为糖源。此时Ara与少量的C蛋白结合，形成诱导型C蛋白-Cind，它作为正调控因子与araI 结合，促进了araPBAD 的转录，产生了3种酶，促进Ara的分解。 （3）当无Ara或用完后，C蛋白（Crep ）与araO1结合，阻碍RNA聚合酶在此区域结合，关闭操纵子；或与araI 和araO2 结合，形成环状，阻遏了PBAD和 PC启动。,2019/6/25,81,PBAD,Cind,Ara cAMP,CAP,RNA pol,araO2,araI,A: 诱导,B: 阻遏,C C C C,+1,-100

30、,-200,-300,2019/6/25,82,7.5 翻译水平的调控,7.5.1 翻译的自我调控 1、翻译产物的蛋白质作为调控分子，直接结合在mRNA的翻译起始位点，调节翻译的效率，如核糖体蛋白。,2019/6/25,83,在核糖体组装时，与rRNA结合的蛋白为关键蛋白，它对核糖体蛋白的合成起调控作用。 每一个操纵子编码自己的关键蛋白，它抑制整个操纵子的表达。,2019/6/25,84,某种r蛋白合成过快时，r蛋白可与其模板mRNA上的SD序列结合，而使其不能与核糖体结合，导致mRNA的降解而使这种r蛋白合成速度降低。,2019/6/25,85,2019/6/25,86,2、 mRNA形成特

31、定的二级结构，起调控作用。,2019/6/25,87,2019/6/25,88,3. 重叠基因对翻译的影响,重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。 偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。,A基因,B基因,A基因终止密码子与B基因的起始密码子重叠,2019/6/25,89,trp操纵子trpE基因与trpD基因的翻译偶联机制,trpE苏氨酸苯丙氨酸终止,ACU-UUC-UGA-UGG-CU,AUG-GCU,甲硫氨酸丙氨酸trpD,2019/6/25,90,4、稀有密码子对翻译的影响,2019/6/25,91,实验证据 RNA引物由dnaG基因编码的引物酶催化合成；

32、dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子； 基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。,2019/6/25,92,由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。,2019/6/25,93,5、反义RNA的调节作用,反义RNA（ antisenseRNA）： 能与mRNA互补结合，从而阻断mRNA翻译的RNA分子,mRNA 5,反义RNA,AUG,+1,S-D,3,以大肠杆菌外膜蛋白的表达为例，说明反义RNA的调控作用。 大肠杆菌外膜蛋白有两种：OmpC

33、和OmpF。它们的表达受渗透压的调节。 渗透压高：OmpC合成增多，OmpF的合成受到控制； 渗透压低：OmpF合成增多，OmpC的合成受到控制。,2019/6/25,95,图 10.46 渗透压增加使EnvZ 活化，该酶激活 OmpR, OmpR引起 micF 和ompC 的转录。 micF RNA(174nt) 与 ompF mRNA的5端互补，阻止 ompF mRNA 的转录。,2019/6/25,96,Figure 10.45 反义RNA 可影响目标 RNA 的功能和稳定性。 1）调控翻译的起始； 2）调控RNA的稳定性； 3）调控转录的终止。,2019/6/25,97,Figure

34、10.48 Antisense RNA can be generated by reversing the orientation of a gene with respect to its promoter, and can anneal（退火） with the wild-type transcript to form duplex RNA.,2019/6/25,98,6. 魔斑核苷酸水平对翻译的影响,科学上，把培养基中营养缺乏，蛋白质合成停止后，RNA合成也趋于停止这种现象称为严紧控制（rel+）；反之则称为松散控制（rel-）。研究发现，在氨基酸缺乏时，rel+菌株能合成鸟苷四磷酸（ppGpp）和五磷酸（pppGpp），而rel-菌则不能。,2019/6/25,99,GTP+ATPpppGpp+AMPppGpp ppGpp的主要作用可能是影响RNA聚合酶与启动子结合的专一性，从而成为细胞内严紧控制的关键。当细胞缺乏氨基酸时产生ppGpp，可在很大范围内做出应急反应，如抑制核糖体和其他大分子的合成，活化某些氨基酸操纵子的转录表达，抑制与氨基酸运转无关的转运系统，活化蛋白水解酶等。,