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1、第八章 核移植技术与动物克隆,Animal Cloning Technology,1,引言 核移植技术概念、类型与原理 核移植操作程序 核移植技术的应用 核移植存在问题,2,主要内容,3,精卵结合,胚 胎,细 胞,个 体,Clone 源于希腊文klon，嫩枝的意思，是指从树上取下嫩枝，栽在地上以成另一棵树。 美国生命伦理顾问委员会则认为，克隆一词指细胞、植物、动物或人的精确的遗传复制。用无性方式产生的后代群体。 欧洲委员会认为，克隆是生产遗传上等同的生物的方法。通过无性形式由单个细胞产生的，和亲代非常相似的单个动物后代 。 名词，一群具有相同基因型的微生物。,4,克隆=复印,Creating
2、Dolly！,1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界。,if they are able to clone outstanding racehorses?,动物克隆技术包括：核移植技术、卵裂球培养、胚胎分割技术。 核移植技术是最常用的动物克隆技术，是哺乳动物体细胞克隆的核心技术。,9,克隆一词在分子、细胞、个体三个水平上都有使用。 分子水平克隆：基因克隆 细胞水平克隆：制备单抗杂交瘤的细胞克隆。 个体水平克隆：动物克隆和植物克隆(用组织培养技术生产的植物）,10,微细胞：只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外
3、面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。 利用秋水仙素先将细胞阻断在染色体中期，然后培养，再用细胞松弛素B处理得到。 以微细胞作供体，通过与遗传性完整的受体细胞融合，可以将微细胞内所含有的几条染色体转移到受体细胞中去。,微细胞核移植,12,胚胎核移植技术历史发展,核移植起始于用微吸管对阿米巴等原生动物进行的核操作。 诺贝尔奖获得者德国胚胎学家Spemann1938年提出将胚胎细胞核移植到去核的卵母细胞中构建新胚胎的设想。 1952年Briggs和Kings获得非洲豹蛙的胚胎克隆后代。 1961年，我国科学家童第周等以金鱼和鳑鲏鱼为材料，得到鱼类不同亚科间的细胞核移植鱼。 1975年Bromhall证
4、实家兔胚胎细胞核移植可行。 1978年，将黑斑蛙成体红细胞的细胞核移入去核的未受精卵内，卵子最后发育成正常的蝌蚪。 随后，胚胎克隆技术在20世纪80年代得到了迅速发展，相继获得了小鼠、绵羊、牛。 1997年，英国Wilmut等人报道了绵羊“多莉”诞生。随后成年体细胞核移植技术得到了迅速发展。,13,15,哺乳类的移核实验必须在一种很精密的仪器显微操作仪下才能进行。 最早用来做移核试验的哺乳动物是小鼠。 1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。 1981年1月，美国科学杂志封面刊登3只小鼠的照片，他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移
5、核卵发育至囊胚期，再将胚胎植入同步孕鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。,16,绵 羊 1997 小 鼠 1998 牛 1998 山 羊 2000 张涌 西北农林科技大学 猪 2000 兔 2001 大 鼠 2003 周琪 中科院动物所 狗 2005,17,体细胞核移植技术历史发展,定义 ：将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到完全复制。,一、 核 移 植 技 术 简 介,核移植技术的类型,核供体的来源：胚胎细胞核移植技术 干细胞核移植技术 体细胞核移植技术 核移植目的：生殖性克隆 治疗性克隆 供受体种间关
6、系: 同种核移植 异种核移植,19,二、 核 移 植 分 类,生殖性克隆,异种核移植,生殖性克隆,意大利：安蒂诺里,法国：布瓦舍瑟里耶,人类克隆？,新华网北京2002年12月27日电，驻外记者毛磊、颜亮、潘治、卢苏燕及总社记者姜岩报道，邪教组织雷尔教派的科学家宣称“培育出世界上第一个克隆婴儿”后，世界科学界表示质疑和强烈指责。 法国女科学家、雷尔教派成员布里吉特布瓦舍瑟利耶宣布，这名克隆女婴名叫“夏娃”，目前“健康状况良好”，将在天后回到家中。 她的生育母亲和克隆母亲是同一位现年31岁的美国妇女。布瓦舍瑟利耶没有透露这名克隆女婴的出生地点。,由邪教组织雷尔教派资助成立的“克隆援助”公司称，世界
7、上第三个“克隆婴儿”已经出生，是日本人。,First human clone by placing human nucleus into a cows egg and growing it to 32-cell stage. Nov 1997,Clonaid claims also to have created first human clones and plans for reproductive cloning. - CNN, 27 Nov 2001,据羊城晚报报道，中山医科大学陈系古教授等今年1月以来先后使用“核移植”技术将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过2000多次实验，成
8、功克隆出100多个人类胚胎，其中部分发育到“桑葚胚”阶段。 这是国际上首次用该技术克隆出人类胚胎，标志着中国在治疗性克隆领域获得重大突破并走在国际最前沿。,该实验中心在国际上率先使用被丢弃的人体皮肤作为供体，家兔卵母细胞作为受体，克隆出100多个人类胚胎，这些胚胎与供者（一名七岁小男孩）的基因相合度超过99999% 可以用做治疗性克隆研究途径，进而获取具有全能分化潜能的人类胚胎干细胞。干细胞可在体外诱导分化，克隆出人体全身所有的200多种组织和器官。,克隆动物问世以后,证明了克隆技术在人类应用的可能性； 人类可从父母生育子女的时代向父母制造子女（胚细胞核移植）和复制自我（体细胞核移植）的世代的
9、转变，并产生一系列的伦理问题，如单亲可以生殖，导致对传统家庭的冲击；,可能出现某个疯狂的人，用克隆技术大量复制自己； 由于法律、伦理及宗教本身等方面的原因，以及克隆技术本身的缺陷可能对人类造成的不利影响。,克隆人的社会地位不确定（父子关系？还是孪生兄弟？）、违背自古以来人类遵循的有性繁殖方式； 婴儿像产品一样在实验室里被制造和处理、生命的权利和尊严被人为操纵； 以及由此造成的家庭结构和社会伦理的混乱都是人类不得不面对的棘手问题；,实际上，无性繁殖是一种低级的生殖方式，一套不变的基因组易发生突变，从而容易出现克隆生物个体的畸形、早衰、早产、流产和死胎等，这将给克隆人及其家庭带来极大的伤害；,发胖
10、的Dolly-安乐死,各国政府对克隆技术在法律和伦理方面可造成的影响非常重视，有些国家成立专家小组研究这一问题，并禁止从事人的克隆研究。 诺贝尔和平奖得者约瑟夫.罗特布拉特把这项技术突破和毁灭作用与制造原子弹相提并论。,全世界目前已有23个国家明令禁止生殖性克隆。 例如，美国总统布什于2001年8月9日宣布将允许国立卫生研究院（NIH）有限度地资助胚胎干细胞研究，但仅限于现有的60多个胚胎干细胞系。 日本:人类胚胎干细胞当前仅限于基础性研究。,细胞治疗 组织替代 器官移植,治 疗 性 克 隆,医疗性克隆被支持,1970年Martin Evans首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞 1998年在
11、人胚囊内层细胞分离出人的胚胎干细胞是到目前通过核移植技术获得的第1例人胚胎干细胞,治疗性克隆技术途径包括以下几个步骤： 首先取病人体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞； 在早期胚胎形成后，从中分离获得人ES 细胞； 对ES细胞进行基因修饰和定向分化研究； 将定向分化后的细胞移植给病人。,胰岛细胞、血细胞、心肌细胞、神经元、肝细胞,体细胞生检、摘除供体卵母细胞,比如帕金森氏病、痴呆症及其他一些神经细胞疾病，都是因为神经细胞出现了障碍。科学家假如能够利用克隆的办法得到胚胎干细胞，然后诱导出所需要的一些目的细胞(即治疗所需要的细胞)，临床治疗时就可以动手术把不好的细胞去除，把好的细胞种上去。这样，
12、帕金森氏病就可以从根本上得到恢复。,糖尿病也一样。胰腺细胞出了毛病，医生可以动手术把出毛病的细胞去掉，把诱导出来的正常细胞种上去，细胞长好了，糖尿病就可以根治。 而现在糖尿病都是注射胰岛素，实际上都是通过药物来维持，而不是真正根治。,“这个工作过去在很多国家有不同的看法，认为人的细胞怎么能放到动物去核的卵子中去。其实这只是一个研究工作。我们所做的这些动物模型研究最终也是服务于人的。 因为人类的卵子很难得到，如果能用动物的卵子作为万能卵子，把人的体细胞放进去进行培育，又假设将来能成功培育出胚胎干细胞并诱导出目的细胞，移到人身上治疗疑难疾病，同时对人又没有什么坏处的话，那么这个方法还是很重要的。,
13、克 隆 动 物 的 鉴 定 DNA 指 纹 ：指每个个体所特有的基因多态性 鉴定方法：RAPD 微卫星 RFLP DOLLY的鉴定：微卫星,胚胎细胞核移植,以胚胎细胞为核供体，因为分化程度低，核移植容易成功。 胚胎干细胞为核供体，成功的克隆出多种胚胎克隆动物，为体细胞克隆技术奠定了坚实基础。,44,体细胞核移植,相关技术 恢复体细胞核全能性的“血清饥饿培养法” 体细胞的传代阶段确定 体细胞克隆后代与亲本核供体间的DNA微卫星分析技术 两种方案：供体细胞核控制在G0-G1期，采用M期去核卵母细胞为受体（适宜于培养的体细胞）；提前将受体卵母细胞激活，降低MPF水平（适宜于胚胎细胞）。,45,277
14、次乳腺细胞核移植实验； 获得29个发育为8细胞的“胚”； 13头代孕母亲； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。,多利于1996年7月5日出生，2003年2月14日死亡。维尔穆特领导培育的世界上第一只体细胞克隆动物-克隆羊“多利”于2003年2月因肺部感染而死亡,患关节炎时的多利,三 、核移植原理,胚胎、胚胎干细胞、胎儿成纤维细胞、成体细胞的每一个细胞核具有相同的遗传物质。 已经发生分化的胚胎细胞核移植到成熟的卵母细胞中，因为特殊因子作用，使植入核基因表达被重新编程或调整，将“发育钟”拨回到受精状态，即恢复“全能性”（totipotent)。 已经分化的细胞经过去分化培养后，同
15、样具有潜在发育潜能，可以恢复全能性。,48,四、核移植技术的一般程序,核受体细胞的准备 核供体细胞的准备 核移植 激活 重构胚胎的培养 胚胎移植 体细胞克隆动物的鉴定,49,50,1 。 切开卵母细胞透明带 2 挤出卵母细胞细胞核3 注入供体细胞核 4 电融合仪融合 5. 培养,1,2,3,4,5,核受体细胞的准备,去核的卵母细胞的细胞质中含有某种特定的因子，使得移植核中所有的基因表达程序重新排列即“重编程”，使已经分化的细胞重新回到发育原点，同受精卵一样开始个体发育。 受体细胞的种类：卵母细胞、受精卵、2-细胞胚胎。 其中卵母细胞最为普遍。作为核移植受体的处于第二次减数分裂中期（MII）的卵
16、母细胞可以经超排卵或体外成熟培养的卵巢细胞得到 卵母细胞的来源： 超排后从输卵管中冲出成熟的M卵母细胞； 屠宰场收集卵巢，吸出卵丘卵母细胞复合体，在体外进行成熟培养后作为受体； 玻璃化冷冻保存的卵母细胞解冻后作为受体。 核受体去核的方法：化学处理法，紫外光灭活染色体法、显微手术法（盲吸法：固定针120/30 m ，去核针25-30m第一极体和极体下面的1/3细胞质）,51,核供体细胞的准备,核供体细胞必须是完整的二倍体细胞，保证供体动物完整的基因组；能够在受体细胞质作用下细胞分化过程倒转，能够重新像受精的合子一样发育成一个正常动物个体的全过程。 核供体细胞两大类：胚胎卵裂球（早期用合子核到64
17、-细胞期的胚胎细胞核质体或分裂球。链霉蛋白酶消化除去透明带，用0.25的胰蛋白酶消化吹散）和体细胞（消化组织后低速1000r/min离心后，上清液高速3000r/min离心即可收集到） 其他来源：胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞 胚胎细胞克隆应用最为普遍，体细胞克隆意义最大。,52,核移植,常用的方法： 胞质内注射（外径5-8注核针吸供体核后直接注射胞质内） 透明带下注射（将供体核注射在带下的卵周隙中，用电刺激进行融合）,53,激活,卵母细胞激活后发生的一系列反应是胚胎发育所必需的。激活后，形成原核，重新进行发育。 激活原理： 通过电刺激、钙离子载体等方法，使得卵母细胞从M解放出来，转到“受精”状态
18、。 激活方法： 瞬时直流电脉冲法和化学试剂法（5乙醇5min，离子霉素4min，SrCL2等),54,重构胚胎的培养,经过融合或者激活的重组胚胎移入中间受体作体内培养或者体外直接培养至囊胚。 方法：牛羊琼脂包埋活移入休情期的结扎的输卵管内培养4-7天，发育为桑椹胚和囊胚。猪移入同期化的输卵管内培养7天可以发育为扩张囊胚。 重组胚胎核形态的重塑：核膨大，核仁消失，染色体凝集，核膜破裂，然后重新形成核膜；早熟染色体凝集（PCC），供体和受体细胞所处周期一致即可；供体核基因组基因（转录）的重新启动时间和启动表达程序。核仁形态变化是核执行功能的标志，涉及到RNA的合成和核糖体的生产。,55,胚胎移植,
19、受体母畜的选择：当地优良品种，皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强，体格稍大。 同发处理 移植部位：输卵管和子宫角,56,五、核移植技术的应用,制备转基因克隆动物，进行生物药物的生产。 培育优良畜种，扩大优良种群。 开展异种动物克隆，拯救濒危动物。 与干细胞技术结合，开展治疗性克隆。 利用核移植技术研究生物学的基本问题。,57,六、核移植技术存在的问题,1.成功率低，为1-5。 (1) 营养过多发育过快，克隆动物一般都有发育过快的问题，体外培养的时间过长或培养液的成分可能与克隆动物的流产以及出生后不久死亡有关。 (2) 线粒体问题 目前还不知道原本就存在于卵子里的线粒体到底在多大程度上与个体的性
20、质有关，细胞核的遗传基因与线粒体的遗传基因相互影响的问题必须引起重视。 (3) 核的重新编程不完整，染色体倍数不正确、性别等都可能对克隆动物的质量产生影响，因为目前所得到的体细胞克隆动物大多为雌性，因此性别可能对体细胞克隆的成功率一定的影响。（端粒问题争论颇多）,58,2.理论研究滞后技术研究 3.体细胞克隆后代可能出现老化现象（受到体细胞分裂代数影响， 克隆动物异常，胎儿或新生儿死亡率极高, 极少数能全程发育的个体也表现为超重、呼吸系统疾病等异常表型, 个别表型正常者也存在有免疫缺陷、关节炎或肾、脑畸形等问题,导致克隆动物后期死亡） 4.核移植技术环节尚需要不断完善。,59,七、核移植相关理
21、论的研究进展,卵母细胞的成熟与激活机理的研究为核移植胚胎的激活提供了理论参考依据； 细胞分化机理的研究将有助于从分子水平揭示分化的物理化学变化，从而为更好的去分化研究提供参考； 胚胎早期基因表达可揭示生命启动的分子变化（胚胎发育由母源控制向合子控制的转变标志胚胎细胞分化开始）； 核移植胚胎的核质互作则是核移植胚是否成功发育的关键（核是细胞分化的物质基础，胞质提供了分化的微环境，控制着细胞的分化）； 体细胞去分化研究为体细胞核移植提供了可能（体细胞去分化培养，获得全能性，G0期细胞。,60,八、影响核移植效果的因素,核移植受体细胞对克隆胚胎发育的影响（受体细胞类型对核移植胚胎重建和发育的影响；卵
22、母细胞来源和发育时期对核移植胚胎重建的影响） 核移植供体细胞对克隆胚胎发育的影响(供体细胞发育时期和细胞周期对胚胎克隆的影响；核移植供体细胞类型） 核质互作与同步化 卵母细胞的活化与克隆胚激活方法,61,克隆的伦理,克隆羊的诞生也从理论上，表明了人类可以自身进行无性繁殖的可能性。 如果克隆技术应用于人类，必将对人类社会的基本组织单位家庭产生很大的冲击，同时也一定会直接威胁人类社会现有的法律、伦理和道德。 多个国家政府已经明确宣布政府科研基金决不会支持任何将克隆技术应用于人类的研究。,62,63,64,65,66,多莉,克隆猴,细胞工程 安利国 科学出版社 动物胚胎工程 马保华 自编教材,67,参考书目,思考题,1.克隆与核移植的概念以及类型 2.核移植操作程序 3.核移植技术的应用,68,