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1、,1,蛋白质的生物合成 （翻译） Protein Biosynthesis，Translation,第 十 二 章,2,蛋白质的生物合成，即翻译，就是将核酸中由 4 种核苷酸序列编码的遗传信息，通过遗传密码破译的方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基酸的排列顺序 。,3,蛋白质合成体系 Protein Biosynthesis System,第 一 节,4,20种氨基酸(AA)作为原料 酶及众多蛋白因子，如IF、eIF ATP、GTP、无机离子,参与蛋白质生物合成的物质包括,三种RNA mRNA（messenger RNA, 信使RNA） rRNA（ribosomal RNA, 核蛋白体RNA）
2、 tRNA（transfer RNA, 转移RNA）,5,一、翻译模板mRNA及遗传密码,mRNA是遗传信息的携带者,遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子(cistron)。,6,原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron) 。,7,PPP,mG -,5,3,蛋白质,真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子(single cistron) 。,8,mRNA上存在遗传密码,mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码(tripl
3、et coden)。,起始密码(initiation coden): AUG,终止密码(termination coden):UAA，UAG，UGA,遗传密码表,10,从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF)。,11,1. 连续性(commaless),遗传密码的特点,编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。,12,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。,1
4、3,2. 简并性(degeneracy),遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。,14,3. 通用性(universal),蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。 密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,15,4. 摆动性(wobble),转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。,U,摆动配对,17,密码子、反密码子配对的摆动现象,二、核蛋白体是多肽链合成的装置
5、,核蛋白体的组成,原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式:,A位：氨基酰位 (aminoacyl site),P位：肽酰位 (peptidyl site),E位：排出位 (exit site),21,三、tRNA与氨基酸的活化,反密码环,氨基酸臂,22,tRNA的三级结构示意图,23,（一）氨基酰-tRNA合成酶 (aminoacyl-tRNA synthetase),氨基酸的活化,两步反应,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E AMP PPi,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNAAMPE,25,在此反应中，特异的tRNA3端CCA上的2或3位自由羟基与相应的活化氨基酸以酯键相连接，形
6、成氨基酸tRNA，从而使活化氨基酸能够被搬运至核蛋白体上参与多肽链的合成。 氨基酸tRNA的合成，可使氨基酸 活化；搬运；定位。,26,氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性，这是保证tRNA能够携带正确的氨基酸对号入座的必要条件。 氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性。 目前认为，该酶对tRNA的识别，是因为在tRNA的氨基酸臂上存在特定的识别密码，即第二套遗传密码。 氨基酰-tRNA的表示方法： Ala-tRNAAla Ser-tRNASer Met-tRNAMet,27,真核生物： Met-tRNAiMet 原核生物： fMet-tRNAifMet 原核生物起始密码子需
7、要在Met-tRNAmetf上进行甲酰化，而真核生物不需要。,（二）起始肽链合成的氨基酰-tRNA,28,蛋白质生物合成过程 The Process of Protein Biosynthesis,第 二 节,29,翻译的起始(initiation) 翻译的延长(elongation) 翻译的终止(termination ),整个翻译过程可分为 ：,翻译过程从阅读框架的5-AUG开始，按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。,30,一、肽链合成起始,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物 (translational initiation co
8、mplex)。 多种蛋白质因子参与这个过程，称为起始因子（initiation factor,IF）,31,原核、真核生物各种起始因子的生物功能,32,（一）原核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚基分离； mRNA在小亚基定位结合； 起始氨基酰-tRNA的结合； 核蛋白体大亚基结合。,IF-3,IF-1,1. 核蛋白体大小亚基分离,IF-1：占据A位防止结合其他tRNA,IF-3：促使大小亚基分离，并提高P位对起始tRNA的敏感性,IF-3,IF-1,2. mRNA在小亚基定位结合,35,在原核生物mRNA的起始密码前813核苷酸的位置，有一非常保守的序列：AGGAGG-,1、S-D序列（
9、核糖体结合序列）,mRNA在核蛋白体上定位的机制：,36,S-D序列：在原核生物mRNA的起始密码前813核苷酸的位置，有一非常保守的序列，与核糖体小亚基上的16S-rRNA结合，引导mRNA进入核糖体，这样的序列称为S-D序列。,37,2、S-D序列后的小核苷酸序列，可以被核蛋白体小亚基蛋白rpS1识别结合,RNA-RNA与RNA-蛋白质相互作用使得mRNA在核蛋白体小亚基上精确定位,IF-3,IF-1,3. 起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基,IF-2：常与GTP结合，促进起始tRNA与小亚基结合,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4. 核蛋
10、白体大亚基结合，起始复合物形成,同时IF-2结合的GTP水解放能，促使三种IF因子释放,同时IF-2结合的GTP水解放能，促使三种IF因子释放,41,（二）真核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚基分离； 起始氨基酰-tRNA结合； mRNA在核蛋白体小亚基就位； 核蛋白体大亚基结合。,真核生物翻译起始复合物形成过程,43,二、肽链合成延长,指根据mRNA密码序列的指导，依次添加氨基酸从N端向C端延伸肽链，直到合成终止的过程。,肽链延长在核蛋白体上连续性循环式进行，又称为核蛋白体循环(ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步： 进位(entrance) 成肽(p
11、eptide bond formation) 转位(translocation),44,延伸过程所需蛋白因子称为延长因子(elongation factor, EF) 原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts) EF-G 真核生物：EF-1 、EF-2,45,肽链合成的延长因子,（一）进位,指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。,又称注册(registration),47,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,EF-Tu促进氨基酰tRNA进入A位,(失活),(活性),Tu有两种形式: Tu-GTP 和 Tu-GDP,Ts为调节亚基,48,（二）成肽,是
12、由转肽酶(transpeptidase)催化的肽键形成过程。,49,（三）转位,延长因子EF-G有转位酶活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动 。,N端,50,51,肽链的延长在核蛋白体上连续循环进行，每加上一个氨基酸需要三步反应：,进位 成肽 转位,核蛋白体循环,52,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。 另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,（四）真核生物延长过程,53,三、肽链合成的终止,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称
13、为肽链合成终止。,54,终止相关的蛋白因子称为释放因子 (release factor, RF),一是识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。 二是诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋白体上释放。,释放因子的功能,原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：eRF,55,原核肽链合成终止过程,核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入受位。 1识别：RF识别终止密码，进入核蛋白体的A位。 2水解：RF使转肽酶变为酯酶活性，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放。 3解离
14、：通过水解GTP，使核蛋白体与mRNA分离，tRNA、RF脱落，核蛋白体解离为大、小亚基。,56,多聚核蛋白体(polysome),使蛋白质合成高速、高效进行。,电镜下的多聚核蛋白体现象,58,蛋白质合成后加工和输送Posttranslational Processing & Protein Transportation,第 三 节,59,从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。,主要包括,多肽链折叠为天然的三维结构 肽链一级结构的修饰 高级结构修饰,60,一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质,新生肽链的折叠在肽链合成中、合
15、成后完成，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。 一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。 细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。,61,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,1. 分子伴侣 (molecular chaperon) 2. 蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI) 3. 肽-脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI
16、),62,1. 热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 2. 伴侣素(chaperonins) GroEL和GroES家族,分子伴侣 molecular chaperon,分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用 结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,64,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,伴侣素的主要作用 为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,65,Chap
17、eron是指欧洲中世纪少女成年后初次参加社会交际活动中陪伴她的年长妇女，这里借用来形容伴随新生肽链并帮助它折叠和成熟为具有完整结构和功能的蛋白质,显然十分贴切 实际上，分子伴侣并未加快折叠反应速度，而是通过消除不正确的折叠，增强功能性蛋白质折叠的产率促进天然蛋白质折叠,66,蛋白二硫键异构酶,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分重要，这一过程主要在细胞内质网进行。,二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,67,肽-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺
18、反两种异构体，空间构象明显差别。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,68,二、一级结构的修饰,69,（三）多肽链的水解修饰,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,70,三、高级结构的修饰,（一）亚基聚合 只有形成最高级结构才有蛋白质的功能 （二）辅基连接 天然蛋白质通常为结合型蛋白，含有金属离子、糖类等等的辅基 （三）疏水脂链的共价连接 某些蛋白质，如G蛋白、Ras蛋白等，需要部分嵌入膜内发挥作用，所以需要在肽链特点位点共价连接一个或者多个疏水性强
19、的脂链,71,蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。,四、蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质的靶向输送(protein targeting),72,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列 。, 信号序列(signal sequence),73,靶向输送蛋白的信号序列或成分,74,（一）分泌蛋白的靶向输送,真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网。,信号肽(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。
20、,75,信号肽的一级结构,76,信号肽识别颗粒,signal recognition particles,SRP SRP与新生肽链的N端的信号肽（GTP)结合，并结合到核蛋白体上，使得翻译的延长暂时停止 SRP存在于真核细胞的胞液中，内质网膜上有一种SRP受体，可结合SRP，所以又称为SRP对接蛋白（DP）,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,（二）线粒体蛋白的靶向输送,（三）细胞核蛋白的靶向输送,80,蛋白质生物合成的干扰和抑制 Interference & Inhibition of Protein Biosynthesis,第 四 节,81,蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶
21、点。它们就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能，干扰和抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。 可针对蛋白质生物合成必需的关键组分作为研究新抗菌药物的作用靶点。同时尽量利用真核、原核生物蛋白质合成体系的任何差异，以设计、筛选仅对病原微生物特效而不损害人体的药物。,82,抗生素(antibiotics) 是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物。,抗代谢药物 指能干扰生物代谢过程，从而抑制细胞过度生长的药物，如：6-MP。,某些毒素也作用于基因信息传递过程。,83,一、抗生素类,是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物 四环素族 氯霉素 链霉素 嘌呤毒素 放线菌酮,84,抗生素抑制蛋白
22、质生物合成的原理,85,嘌呤霉素作用示意图,嘌呤霉素与Tyr-tRNATyr相似,竞争性掺入肽链的延长过程，中断肽链的合成 作用于真核及原核生物，无特异性，难作为抗菌药，而是试用于肿瘤治疗,四环素族 -抑制tRNA进入A位,87,二、其他干扰蛋白质生物合成的物质,毒素(toxin) 在肽链的延长过程中阻断蛋白质合成而引起毒性 干扰素(interferon) 真核细胞感染病毒后分泌的一类有抗病毒作用的蛋白质，它能抑制病毒繁殖,88,白喉毒素(diphtheria toxin)的作用机理,白喉毒素,+,+,白喉毒素使得延长因子-2发生ADP糖基化失活,89,干扰素的作用机理,1. 干扰素诱导eIF2磷酸化而失活,抑制病毒蛋白质的合成,90,2. 干扰素诱导病毒RNA降解,