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1、第一章 PCR技术原理,定义: PCR技术又称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),是通过模拟体内 DNA 复制的 方式,在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。,PCR技术:,PCR概念的提出,1971年,美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 1983,Kary Mullis 1993年获得诺贝尔奖,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,技术难点,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌
2、 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。,thermus aquaticus,Taq DNA聚合酶的发现,1988年Saiki 等从温泉( Hot spring)中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。,耐高温, 在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年,Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Mo
3、lecule of the year),Taq DNA聚合酶优点,1、PCR技术的基本原理,在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,PCR技术的基本原理和工作方式,模板DNA,2.PCR工作方式,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物
4、2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,3.PCR基本材料,模板:单链或双链DNA 引物:16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶:耐热的DNA聚合酶 底物:四种脱氧三磷酸核苷 (dNTP: dATP、dTTP、dCTP
5、、dGTP) Mg2+: DNA聚合酶的激活剂,4.PCR反应程序,9496 30-3 预变性(使模板DNA充分变性) 94 30 变性 50-60 30-1 复性(使引物与模板充分退火) 72 n(按1扩增1kb计算)延伸 72 3-7 总的延伸(使产物延伸完整) 4-10 保存,5.PCR要素解析,1)复性和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素,通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定(低于Tm 值2-3 )。 延伸温度绝大多数设定为 72 。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法 PCR 。 2)反应时间 变性一般使
6、用 30 秒钟,如果模板的 G+C 含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。 复性时间有 30 秒种一般是足够的。 延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。,5.PCR要素解析,3)循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关,循环数通常为 2535 次。 平台效应(plateau effect):PCR 扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因:底物和引物的浓度已经降低,dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 ,产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用,非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用,扩增产物自身复性,高浓
7、度扩增产物变性不彻底。,5.PCR要素解析,4)PCR 反应液的配制顺序 最后加入 DNA 聚合酶。 早期的 PCR 仪没有带加热的盖子,要求在反应液上覆盖一层矿物油,防止水分蒸发。 热启动(hot start)PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。,5.PCR要素解析,5)各种成分浓度作用: 缓冲液:提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM TrisHCl ( pH8.3-9.0),1.5mM MgCl2, 50mM K+ dNTP(底物):等摩尔浓度的 4 种 dNTP(即 dATP、 dTTP、dCTP和dGTP), 终浓度一般为 200mM(即饱和浓度), dNTP 的浓
8、度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。 引物: 1M/L,5.PCR要素解析,模板:单、双链DNA均可。 模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过 高会导致反应的非特异性增加。 DNA聚合酶: 最常用的是Taq DNA聚合酶,最适反应温度72。 Pfu DNA聚合酶:是目前使用最广泛的具有 3-5 外切活性的 PCR 酶,目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。, 长度:至少 16bp ,通常为 18-25bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性,但会提高扩增的有效性 引物的解链温度:两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5 。 对于小于 20
9、个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算,即 Tm=4(G+C)+2(A+T)。 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体(特别是引物的 3端)。 G+C 含量:尽量控制在 40% 至 60% 之间, 4 种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列,以及 T 在 3 末 端的重复排列。 引物的 3 末端最好是 G 或 C ,但不要 GC 连排。,5.PCR要素解析:引物设计,6. PCR技术特点,1)高度的灵敏性,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性;同时尽可能减少非特异性扩增。,6. PCR技术特点,1)特
10、异性,3)操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。,6. PCR技术特点,4 )用途广泛,生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学,6. PCR技术特点,1、2Taq PCR MasterMix 2、DNA模板 3、引物:,本次实验所用材料,PCR反应体系,PCR反应程序,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。,琼脂糖,琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳
11、中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中,电荷效应,琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中,分子筛效应,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于
12、糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。,线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系,实验材料,【材料】 1. 琼脂糖 2. 10mg/ml EB 3. marker 4. TAE,实验步骤,【步骤】 1、称1.5g琼脂糖,加100ml电泳缓冲液(1TAE)加热熔化。 2、胶液冷却至60时,加入4l EB,小心混匀,缓慢倒入制胶模具中,在胶一端插上梳子。 3、待胶凝固后,拨出梳子,将模具置于水平电泳槽中,加入1TAE,让液面高于胶面至少1mm。 4、上样。 5、接通电泳仪电源,1-5V/cm电压(一般80100V),
13、开始电泳。 6、根据指示剂迁移位置,判断是否终止电泳。切断电源后,取出凝胶,使用凝胶成像仪进行观察或拍照。,琼脂糖凝胶电泳DNA回收,实验原理,离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜,这种滤膜在低PH值、高浓度盐(盐酸胍,NaI, NaClO4等)存在的条件下,可以选择性吸附DNA片段,而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。 利用硅基质膜的过滤吸附操作,大大简化了核酸纯化过程,提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外,已经有96孔板、
14、384孔板等核酸纯化产品。 目前,硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。,试剂盒组成及储存方法,实验步骤,注意事项,切胶回收DNA时,应尽量使用能量较低的长波长紫外线,并缩短操作时间,以减少紫外线对DNA的损伤。 第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇,加入后及时做好标记,以免多次加入。 各种溶液使用后应及时盖紧,以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。 所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时,立即用大量清水冲洗。 适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30l将降低洗脱效率。,凝胶电泳检测,