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1、1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。 2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术。 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。,酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜
2、二糖和果糖。,实验原理,本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要
3、是外酶。,名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度 外酶 27万 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60 内酶13.5万 3% 双 25mM 150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60,实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。,两种酶的性质对照表如下：,一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定,本实验共有三个分实验：,细胞破壁的几
4、种方法 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆
5、酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出。,（一）蔗糖酶的提取与部分纯化,（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量（约4g）二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的甲苯12ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入1个离
6、心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4，4700rpm，15min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。,操作步骤,（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4，4700rpm，离心15min。 （7）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。 2. 热处理 （1）预先将恒温水浴调到50，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，
7、用4，4700rpm，离心15min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。,3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4，4700rpm，离心15min，量出体积，留出1.5ml（下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分”）。,亲和层析,利用分子与其配体间特殊的、可逆
8、性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。,凝胶过滤层析,利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等），根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法。,离子交换层析,利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力而分离之 改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小的蛋白质先洗脱下来。,离子交换层析(sephorase DEAE fast flow),离子交换层析技术是以离子交换纤维素
9、或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。,在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素OC6 H14NH+，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。 当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素OCH2COO-），其反离子为阳离子（如Na
10、+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。,溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，净电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。,交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机
11、盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。,离子交换剂使用前一般要进行
12、处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na型（即平衡离子是Na离子），阴离子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl，碱是NaOH或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓
13、度一般小于0.5 mol / L，浸泡时间一般30 min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。,柱上操作 交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。 上样向层析柱内倾入样品液 洗脱与收集 不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的
14、单一物质。,离子交换柱层析纯化蔗糖酶 操作步骤 1.离子交换剂的处理： 称取1.5克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加入0.5M NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时（不超过1小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 M HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，再用0.5 M NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。（因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过回收的，按“碱盐”的顺序洗即可（0.5 M NaOH,1 M NaCl 溶液处理），然后水洗至中性。最
15、后保存在20%的酒精溶液中。,2.装柱与平衡： 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。（一般洗2-3个柱体积）,3.上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液和30ml含1MNaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml量杯，一个装30ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入30ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶
16、液的量杯内放入一个小搅拌子，使两杯溶液形成连通，注意两个杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。,用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分，若溶液混浊，则用小试管，10000rpm离心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇级分样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的上清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管3.0ml/3min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，接好层析柱，打开磁力
17、搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速3.0ml/3min。,测定每管洗脱液的A280光吸收值，合并活性最高的2-3管，量出总体积，此即“柱级分IV”。 注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。,各级分蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微量法测定蛋白质含量，参见 实验“蛋白质含量的测定法” 。各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液
18、管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 100倍 热级分II： 100倍 醇级分III： 100倍 柱级分IV： 不稀释,蛋白质含量的测定,标准蛋白质浓度：1mg/ml,蔗糖酶各级分活性的测定 测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelsons试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数Km和最大反应速度Vmax时再用Nelsons试剂法。 费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合
19、加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其兰色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。 级分I、II、III蔗糖酶活性测定 用去离子水代替稀释各级分酶液，试测出测酶活合适的稀释倍数：I ： 10000倍 II ： 10000倍 III ： 100000倍 上清不稀释，平衡峰不稀释 IV洗脱峰稀释100倍 以上稀释倍数仅供参考。,表 1 级分、的酶活力测定 各管名称 对照 粗级分 热级分 上清 醇级分 IV 葡萄糖 管数 1 2 3 4 5 6 7 8 酶液(ml) 0.0 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0 0 H2O(m
20、l) 0.6 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 1.0 0.8 乙酸缓冲液 (0.2mol/L pH4.9) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0 0 葡萄糖2mmol/L 0 0 0 0 0 0 0 0.2 蔗糖0.2mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0 0 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，25度准确反应10min后，立即加碱性铜试剂中止反应。 碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 100水浴加热8min，立即用自来水冷却 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2
21、O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nm,酶活力单位,酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）,在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1U=1mol/min,在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s,1kat = 6107 U,酶的纯度： 总活力=活力单位数/mL酶液总体积（mL） 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白,酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法,稀释后酶液的活力（按
22、还原糖计算）： E=A650*0.2*2/ A650*10*B 式中： A650 第26管所测A650 A650第8管所测A650 0.2 第8管葡萄糖取样量 2 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2mol/ml 10 反应10min B 每管加入酶液ml数,计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表： 级分 I II III IV 记录体积(ml) 蛋白质 (mg/ml) 总蛋白(mg) Units/ml 总Units 比活力Units/mg 纯化倍数 1 回收率% 100,纯化倍数=该步的比活力/第一次的比活力 回收率=该步的总活力/第一次的总活力,试管用后清洗干净，放入烘箱,
23、本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横座标，产物生成量为纵座标，画出酶反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长，曲线斜率不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。,反应时间对产物形成的影响,反应时间对产物浓度的影响 管数 1 2 3
24、 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.2M蔗糖 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 H2O 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.7 1.0 0.8 葡萄糖2M 0.2 碱性铜试剂 1.0 由加酶开始计时 蔗糖酶 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 反应时间min 0 1 3 4 8 12 20 30 40 反应到时后立即向“2-12”管加入1ml碱性铜试剂中止反应 碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 沸水浴上煮8min后速冷 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 测定A650,