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1、第二节 沙门菌检查法,美国细菌学家Salmon与Smith于1885年分离出猪霍乱沙门菌。1990年为纪念Salmon，定名这类细菌为沙门菌属。 沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌。包括伤寒、副伤寒甲、乙、丙型，肠炎，鼠伤寒等沙门菌，现今已发现2324个血清型。 在世界各地的食物中毒中，沙门菌食物中毒常占首位或第二位。规定在药品和食品中不得检出沙门菌。美国每年报道病例45 000个左右，实际数量可能多达200-300万。伤寒每年400-500例。,一、生物学特性,1.形态 两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，（0.4-0.9）m (1-3)m，无芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，少数有包膜。 光滑型的细菌大小均匀，
2、粗糙型则大小不一，长短不一。,2. 培养特性,在营养琼脂平板上18-24h培养形成无色半透明，表面光滑、湿润、隆起的菌落，直径2-3mm。有些菌株在营养琼脂平板上生长不良，形成 “侏儒”菌落，加葡萄糖或甘油，生长良好，但易使菌株粗糙, 呈干燥、无光泽、边缘不整齐。 光滑型菌在肉汤中无菌膜、无沉淀；粗糙型则产生沉淀，上层液透明。 生长温度在10-42，最适38；pH4.5-9，最适pH6.8-7.8；需氧或兼性厌氧。,3. 生化特性,靛基质-，甲基红+，v-p -，柠檬酸盐反应d，产硫化氢，尿素酶反应-，还原硝酸盐， -葡萄糖醛酸苷酶d，不能发酵乳糖，可以被噬菌体裂解。,4. 抗原结构,（1）抗
3、原构造 菌体抗原（o）：不被乙醇、0.1%石炭酸所破坏。与特异性抗血清呈颗粒状凝集，形成慢，不易摇散。现已知有50多种，多数沙门菌含有两种以上的O抗原，有的O抗原是一种菌独有的，有的是几种菌共有的，凡含有共同特异性抗原成分的血清型归为一个群，可将沙门菌化分为42群，按A-Z排列，Z以后的顺序以O51-O67表示。引起人类沙门菌病的95%以上都在A-F 6个群内。,表面抗原（K抗原）：沙门菌中有三种K抗原，即Vi抗原、M抗原和5抗原。 可阻止O抗原被抗O血清所凝集，具有O不凝集性。常用于菌型鉴定。 M抗原：粘液抗原，在菌型鉴定上无特殊意义。 5抗原：,鞭毛抗原（H抗原）：经乙醇或酸处理后失去与特
4、异性抗体的结合力。制备时，应用具有丰满鞭毛的菌种18-24h的培养物，加甲醛固定或60以下加热后即成H抗原。H抗原与抗H血清562h后，可出现疏松易于摇散的絮状凝集。,沙门菌的H抗原有两相，特异性高的称为第1相（特异相）抗原；特异性低的称为第2相（非特异相）抗原；多数沙门菌同一菌株，常可分离出两种H抗原的菌落，菌落的外观性状完全一样，但与相应抗体作凝集反应时则明显不同。具有两相抗原的称为双相菌，仅有一相抗原的则称为单相菌。,（2）抗原变异,Smooth-Transient-Rough变异：为避免R型的出现，保存培养基内不应含有糖类，不要多次移种传代。 V-W（Vi-O）变异：具有Vi抗原的菌株
5、称为V型菌，失去Vi抗原的菌株称为W型菌。W型菌只能同其相应的O型血清发生凝集，而不与Vi血清凝集。 HO-O变异：有鞭毛抗原的HO型菌变为无鞭毛的O型菌。 位相变异：有双相鞭毛抗原的沙门菌两个相可以互变。通常在一个培养物内二相并存，在平板上各占半数，但挑取单菌落，经多次移接后，又出现两相各半现象，这种由一相变为另一相的变异，称为位相变异，单相菌不产生位相变异。,5、 发病机理和症状,菌量大 活菌和菌体内毒素协同作用 小肠和结肠里繁殖，侵入粘膜 ，由淋巴系统进入血液 潜伏期8-48h 急性期，每克粪便中沙门菌多至10亿个,食物中毒的特征性症状 腹泻 恶心 腹痛 低烧和寒颤 有时呕吐、头痛、倦怠
6、,伤寒的典型症状 持续发热39-40 昏睡症 剧烈腹痛（腹部痉挛） 头痛 食欲不振 出现扁平的玫瑰红色点状红疹,（一） 检验程序,供试品,供试液,预增菌,增菌,DHLS.S,EMB MaCC,TSI（三糖铁琼脂）,氰化钾,赖氨酸脱羧酶试验,尿素酶试验,吲哚试验,血清学试验,半固体营养琼脂,革兰染色、镜检,报告,二、沙门菌常规检查法,1.预增菌:,将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养，使受损伤的细菌得以修复，然后再转接至增菌培养基中。 一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用乳糖肉汤作预增菌液。以1：10的比例接种，18-24h,35-37。,预增菌培养基的选择,2.选择性增菌,取1mL预增菌
7、液转种至增菌培养基10mL。3724h，培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养基，我国与英国相同采用后者。美、日采用二者联用有助于提高沙门菌的检出率。,转接到选择性 培养基,免疫 磁性分离技术 （Immunomagnetic separation，IMS）,3.分离培养,选择性培养基： DHL：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色 HE：蓝绿或蓝色，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株黄色、中心黑色 SS：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色,分离沙门菌应以出现单个菌落为准，否则应重新分离。 由于平
8、板用前未烘干，或因分离不良菌落连片均须重新分离。 致病菌菌落一般在经3624h培养后，再放置室温2-3天后不发生变化，而非致病菌则继续增生、增厚，并带黄灰色，并产生臭味。 对可疑菌落可放置室温观察几天，再决定取舍,(1)初步鉴别试验：三糖铁琼脂,乳糖:蔗糖:葡萄糖=10 : 10 : 1 以酚红作指示剂 当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养基均呈黄色；如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于细菌生长分解蛋白胨而释放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色 细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化亚铁。,4.生化试验,斜面红色、底
9、层黄色，出现部分黑色或全部黑色 斜面红色、底层黄色，无黑色 斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色 除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可出现上述反应。 吲哚试验：阴性,志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。 大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S 。 沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生H2S ，多数产气。 下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？,赖氨酸脱羧酶试验,纯培养菌落,赖氨酸脱羧酶,产酸,含糖蛋白胨培养基,溴甲酚紫,产碱(尸胺),CO2,对照为黄色,阳性为紫色 培养时间不超过四天 伤
10、寒和鸡沙门菌除外，均为阳性,含糖蛋白胨培养基,紫色,(3)尿素酶试验,区别变形杆菌 具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生氨，培养基碱性，使酚红变红。沙门菌反应阴性 注意：用无尿素的培养基作对照,(4)氰化钾试验,沙门菌、志贺菌和埃希菌的生长受KCN抑制。 KCN 浓度为1：13300或1：10000。 沙门菌此反应阴性。,待检菌新鲜培养物,KCN培养基,3648h,不生长,铁卟啉,呼吸酶失活,注意： 氰化钾的浓度 控制接种量 试管封口严密 操作谨慎 用后的培养管加硫酸亚铁和氢氧化钾去毒 对照不加 KCN,（5）动力检查,沙门菌周生鞭毛，能运动。 猪霍乱沙门氏菌（S.gallinarum）和
11、鸡白痢沙门氏菌（ S.pullorum）没有运动性,5.血清学凝集试验,（1）沙门菌属诊断血清 诊断血清规格： 10种1套：主要供伤寒、副伤寒沙门菌初步诊断用。包括Vi及A-F群多价血清各1种；O因子血清4种；H 因子血清4种 26种1套：主要供沙门菌常见菌型定群和初步定型用。包括Vi及A-F群多价血清各1种；O因子血清9种；H 因子血清15种,57种1套：主要供沙门菌常见菌型定型用。包括Vi及A-F群多价血清各1种；O因子血清16种； O复合因子血清各1种；H 因子血清31种； H复合因子血清3种 144种全套：供各型沙门菌诊断用。包括诊断各型沙门菌用的各种多价O、多价H血清和单因子及复合因
12、子血清,A-F群O多价血清的代表菌株,根据沙门菌菌型调查结果，95%以上的沙门菌都属于A-F六个O群，常见菌型不过20个左右，因此沙门菌检验，主要是对A-F群沙门菌做出初步鉴定。按常规方法选用A-F群多价O血清。,凝集试验方法,二者比例适当，菌量过多过少均不易观察到正确结果。 阳性反应通常在3min内发生。 血清效价低反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，放一个湿棉球，盖上皿盖，经约20min再观察结果。 出现凝集现象的待检菌培养物，应以灭菌的生理盐水溶液代替A-F多价O血清，与培养物混匀做对照试验，对照应无凝集现象，方可判为阳性反应。,A-F多价O血清,稀释,接种环沾取2-3环,1.5cm0.5c
13、m条形涂抹,待检菌,36 18-24h,接种环刮取少许,混匀,待检菌在生理盐水溶液中产生凝集，称自家凝集现象，这种现象多为S-R所致。 当A-F多价O血清凝集试验为阴性时，还应当考虑是否因为待检菌含有Vi抗原所致。,3、结果判断及报告,（1）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阳性反应，做出供试品检出沙门菌报告。 （2）生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阴性反应，做出供试品未检出沙门菌报告。 （3）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阴性反应；或生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阳性反应；均应进一步
14、鉴定后再做结论报告。,对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生化试验。 糖醇发酵试验 明胶液化试验 硝酸盐还原试验 甲基红试验 VP试验,柠檬酸盐利用试验 半乳糖苷酶试验 苯丙氨酸脱氨酶试验 丙二酸钠试验 有机酸盐利用试验 甘油品红试验,明胶液化试验,被胶原酶分解 判断结果前，冰箱冷却。 明胶的用量与质量 肠杆菌科一般为阴性反应 假单胞菌一般为阳性,硝酸盐还原试验,待检菌,硝酸盐琼脂斜面,30s,培养物,-萘胺1mL,对氨基苯磺酸1mL,阳性,3618-24h,阴性,亚硝酸盐存在,硝酸盐没有被还原（真阴性反应） 假阴性结果:硝酸盐还原成非亚硝酸盐的其他产
15、物，如NH3、N2、NO或N2O和羟胺。 需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。 肠杆菌科细菌皆为阳性反应,苯丙氨酸脱氨酶试验,待检菌新鲜培养物,10%三氯化铁 4-5滴,苯丙氨酸琼脂培养基,3618-24h,苯丙酮酸,阳性,苯丙氨酸脱氨酶,接种培养物要多避免假阴性 立即观察，5min之内 变形杆菌阳性，肠杆菌科阴性,半乳糖苷酶试验,待检菌新鲜培养物,制成浓菌液,36 5min振摇使酶释放,阳性,生理盐水,甲苯1滴,ONPG0.25ml,37 20min、3h、18h、24h,ONPG=邻硝基酚-D半乳糖苷 阴
16、性反应不变色 ONPG为无色 pH7.0，过酸假阴性，过碱假阳性,甘油品红试验,待检菌新鲜培养物,甘油品红肉汤培养基,368d,丙酮酸,乙醛,紫红色醌式化合物,品红,未接种培养基做对照 复红=品红 培养时间长 用于沙门菌属种间鉴别常见沙门菌阴性，乙型副伤寒结果不定,有机酸盐利用试验,待检菌新鲜营养肉汤培养物,有机酸盐培养基,3614d,酸,沉淀,蓝色,每天观察,酒石酸 柠檬酸钠 黏液酸,溴香草酚兰,黄绿色,白色,0.5ml醋酸铅饱和水溶液,阴性反应一直为蓝色并有大量沉淀 沙门菌对右旋洒石酸盐多为阳性，志贺菌为阴性，培养时间长；沙门菌对左旋洒石酸盐反应不同，其他属为阴性 培养时间长 迟缓反应可分
17、别确定发生期 培养基调中性,丙二酸盐利用试验,待检菌新鲜培养物,丙二酸钠培养基,3648h,碳酸钠,绿色,溴香草酚兰,蓝色,先溶酵母膏和盐，调6.8后，再加指示剂 丙二酸钠为唯一碳源 黄色为产酸，阴性 任何蓝色均判为阳性,4、注意事项,培养基 对照 挑取菌落 纯培养 严格按照规定进行 避免对环境造成污染,三、沙门菌噬菌体检验法,注意事项： 平板涂菌前一定要干燥，以琼脂表面稍有皱纹为宜，吸水性好。 试验菌液的浓度以肉眼观察，不呈现明显混浊为宜，不可过浓。 使用棉签涂布菌液时，勿将琼脂表面划破，影响结果。,四 荧光抗体法,增菌液涂片,加荧光抗体3730min,95%乙醇浸洗1-2min,PBSpH
18、9.0冲洗,K氏固定液固定5-10min,PBSpH9.0浸洗10min,蒸馏水冲洗,PBSpH9.0缓冲甘油封片,镜检,专门检测沙门氏菌包括伤寒, 副伤寒沙门氏菌跟其他乳糖 (+) 的菌种 更清楚的区分：沙门氏菌落粉红色到洋红色；其他细菌透明或淡蓝 容易阅读：透明的背景，18-24h培养后有较大的菌落,四 其它方法,ELISA DNA探针 PCR技术,检样,25g+增菌液,挑取可疑菌落3-5个,EMB或Macc,TSI、动力,TSI底层+、斜面-、H2S-、不产气、无动力,血清学分型,进一步生化试验,非左,非志贺菌,生化分群,葡萄糖胺试验、 柠檬酸盐、 LYS-、尿素、KCN、水杨苷、七叶苷,志贺菌分群分型结果,非志贺菌,HE或SS,阳性结果,志贺氏菌检验程序,