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1、口腔生物学,第一章 口腔微生物学,第一节 口腔生态系及其影响因素,生物之间，生物与其环境之间的相互关系称生态系ecosystem,一、生态系和生态学,肠道菌数百种，数量达100兆，重量2千克 显微镜下：花草丛生，丹藤翠蔓，生机盎然,研究生物与其环境的相互依赖和相互制约的科学为生态学（ecology),1985 olker Rush 提出细胞水平或分子水平的生态学为微生态学（microecology) 生态位，小生境 niche 生态点 biotopes 生境 habitat,环境（environment）,生物体周围许多不同复杂程度的实体,生态系建立的中心原则是生物体对其赖以生存环境的影响,二
2、次细菌定植（Secondary bacteria colonization),先锋菌pioneer,定植colonize,环境改变(environment changes),生态连续ecological succession（生态演替） 生物体栖息在一个变化环境中的过程,个体(individual),生物体的社会,群体 (community),极期群落 (climax community),互生mutualism 相互受益 共栖commensahism 一方受益，一方不受损 寄生parasitism 一方受益，一方受损 无损共生amensalism 双方均不受益受损 双方受损共生symecro
3、sis 双方受损,生物间的共生关系symbiosis,二、口腔生态系,人类与正常菌群间的关系 互生,Normal flora 正常菌丛(固有菌丛),口腔,肠道(大肠杆菌),300余种，人体细胞1014，仅10%为哺乳动物细胞，其他为微生物,口腔生态系（oral ecosystem) 口腔正常菌丛之间及其与宿主之间的相互作用,S.mutans,口腔微生物与宿主的相互作用,有益作用 损害作用,有益作用,对外源性微生物的抑制 entagonism, microbial interference 阻止和限制外源微生物的入侵 通过竞争营养物质 产生抑制性代谢产物 占据空间位置 降低PH值 降低氧化还原电
4、势 导致机体产生天然抗体,对宿主免疫系统刺激,唾液腺的神经支配,有助于组织和器官正常发育 定菌动物 肠道发育不良,营养功能 VitK, Biotin, B6, B2 长期使用抗菌素： 营养吸收，维生素代谢障碍，外源性感染,内源性感染 为外源性感染提供条件 pH，Eh值改变，酶的产生 使宿主致敏,损害作用,三、口腔微生物的获得与演替,（一）获得： 胎儿无菌，产道获得，双亲影响,（二）演替 (physiological succession) 1. 新生儿期 2. 幼儿 3. 青春期和成人期,四、口腔生态系的影响因素,软硬组织屏障 获得性膜 复杂的口腔环境 舌、龈上皮、龈沟、颊、腭、 釉质、牙本质
5、、牙骨质,（一）物理化学因素,温度 一般细菌可在-5 55 环境中生存 口腔食品温度变化幅度 60 嗜冷菌 45 嗜温菌 25 37 ,氧张力 绝对需氧菌Obligate aerobes 绝对厌氧菌Obligate anaerobes 兼性厌氧菌facultative anaerobes 耐氧厌氧菌aerotolerant anaerobes 微嗜氧菌microaerophiles,%表示 舌前16.4 舌后12.4 颊褶 0.3,Eh (oxidation-reduction potentials) 指两个电极之间的电位差 +75mV -50mV,pH 氢离子浓度反映为pH值 口腔pH以唾液
6、为代表5.67.6,影响因素 外源性物质: 糖类，酸性、碱性物质 细菌发酵 唾液缓冲能力: 流速,唾液 龈沟液 血素(hemin) 牙龈卟啉菌生长 酶类 透明质酸酶，蛋白酶等,（二）营养物质的利用,唾液 抗体 唾液中主要为sIgA 龈沟液中主要为IgG 2. 蛋白质 糖蛋白 粘蛋白 富脯蛋白 富酪蛋白 过氧化物酶 乳铁蛋白 溶菌酶,（三）宿主因素,糖蛋白 粘蛋白(mutan) 氨基己糖4% MGI 保护、润滑、抗微生物参与获得性膜形成 MGII 凝固细菌,富脯蛋白(proline-rich proteins, HRPS) 参与钙离子浓度调节 富酪蛋白(stathrine) 抑制羟磷灰石形成，使
7、唾液中羟磷灰石达到饱和和促进再矿化。,过氧化物酶 硫氢酸盐抗菌系统(salivary peroxidase),SCN- + H2O2 OSCN- 硫氢酸盐 SCN氧化中间产物,过氧化物酶,乳铁蛋白 (lactoferrin) 能与铁结合，使部分需铁细菌受抑制 溶菌酶 (lysozyme) 能介导细菌聚集，破坏细胞膜，激活细菌 的自溶素,唾液功能 润滑 维持口腔粘膜完整性 软组织修复 维持生态平衡 凝集作用 抗菌作用,细菌附着 1. 粘附(attachment) 2. 细菌间作用 聚集（aggregation） 共聚集（co-aggregation）,（四）细菌因素,第二节 牙菌斑与生物膜,一、
8、获得性膜的形成,细菌非直接附着至牙面 清洁牙面后几分钟数小时内形成 24小时后0.011 m,成份 glycoproteins phosphoproteins lipid Gingival crevicular fluid,获得性膜成分对附着的影响 氨基酸 缺乏系统分析 糖蛋白中的寡糖 oligossacharides 介导初期附着,二、微生物聚集 microbial colonization,（一）初期附着非特异性附着 钙桥学说： 脂磷壁酸 酸性唾液糖蛋白 细菌表面疏水性 (hydrophobicity) 静电学说,Ca+,（二）细菌附着高度选择性（selective manner) 配位体
9、理论 (ligands) adhesin-receptors (oligossacharides),早期附着细菌： S.sanguis S.oralis 占链球菌的95% S.mitis bioran 占细菌总数的50%,S.sanguis 附着至人类唾液糖蛋白终末唾液酸残基,S.oralis has a galactose-binding adhesin Actinomyces viscosus proline-rich protein,statherin,附着至,S.sobrinus glucan,附着至,S.mutans与龋病关系密切，但数量2%初期链球菌 唾液中某种微生物浓度与附着量呈
10、正相关 第一个细胞附着至牙面所需细菌浓度 S.mutans 104105/ml saliva S.sanguis 103/ml,三、微生物演替（Microbial succession) Strepococcus-dominated plaque to a plaque dominated by actinomyces. 原有微生物为继发性微生物生长创造条件,细菌创造一种环境逐渐被其他适应性细菌取代吸引继发入侵者或不利其自身附着。 成熟菌班中无S.orealis,牙菌班变厚，O2缺乏 有利于兼性厌氧菌生长，9天后牙菌班兼性厌氧及厌氧微生物为主 几周后达到平衡,四、成熟牙菌斑 Mature de
11、ntal plaque,早期生长：细胞分裂所致 继之：吸附 玉米棒状 中心丝状菌,玉米棒状,中心丝状,老菌斑： 内层稠密包绕G+菌 pleomorphic 菌 其中放线菌为主，外层松散,菌班附着图,菌斑附着过程,第三节 口腔正常菌群,一、来源 母体 近亲,二、菌丛 固有菌丛 indigenous flora 增补菌丛 supplemental flora 暂时菌丛 transient flora,口腔微生物 细菌 真菌 支原体 口腔原虫 病毒,葡萄球菌属(Staphylococcus) 口腔球菌属(Stomatococcus) 链球菌属(Streptococcus) 消化球菌属(Peptoco
12、ccus)和消化链球菌属(Peptostreptococcus) 奈瑟球菌属(Neisseria) 韦荣球菌属(Veillonella) 放线菌属(Actinomyces) 优杆菌属(Eubacterium) 丙酸杆菌属(Propionibacterium),口腔菌属,双歧杆菌属(Bifdobacterium) 乳杆菌属(Lactobacillas) 罗氏菌属(Rothia) 诺 卡菌属(Nocardia) 嗜血菌属(Hemophilus) 放线杆菌属(Actinobacillus) 艾肯菌属(Eikenella) 口腔金氏菌(K.orale) 弯曲杆菌属(Campylobacter),二氟化
13、碳噬纤维菌属(Capnocytophaga) 拟杆菌属(Bacteroides) 普雷沃菌属(Prevotella) 卟啉单胞菌属(Porphyromonas) 梭杆菌属(Fusobacterium) 纤毛菌属(Leptothrix) 沃林菌属(Wolinella) 月形单胞菌属(Selenomonas) 螺旋体(Spirochaeta),牙周骨组织生物学,蒋 滔,“我知道自己几乎一无所知，对这一点也几乎不知道。” 苏格拉底,牙周组织有再生的可能吗？,为什么受压侧骨吸收，牵引侧骨形成？,骨整合形成的机理是什么？牙周韧带样结构可行吗？,牙周组织(Periodontium),牙周膜 (Period
14、ontal ligament),牙龈 (Gingiva),牙骨质 (Cement),牙槽骨 (Alveolar bone),“做学问要于不疑处有疑，待人要于有疑处不疑。” 胡 适,牙槽骨组织的生物学特点,第一节,一、牙槽骨的组织形态特点,固有牙槽骨,密质骨,松质骨,（alveolar bone proper）,（cortical bone）,（sponge bone）,固有牙槽骨(筛状板、硬骨板）,束状骨（bundle bone）,束状骨（bundle bone）,束状骨（bundle bone）,密质骨,松质骨,牙槽骨,牙槽骨,牙槽骨,二、牙槽骨的生物特征,成分,无机成分 70%,有机成分
15、22%,水 8%,羟基磷灰石,I 型胶原 95,蛋白糖原,非胶原蛋白,形态,密质骨,松质骨,胚胎发育：,膜内成骨,牙槽骨是高度可塑性组织，也是人体骨骼最活跃的部分。,三、牙周其他钙化组织（牙骨质）,牙骨质（按有无细胞）,无细胞牙骨质,有细胞牙骨质,（原发性牙骨质）,（继发性牙骨质）,牙骨质,（按纤维来源以及有无细胞分类）,无纤维无细胞牙骨质,外源纤维无细胞牙骨质,混合纤维细胞牙骨质,内源纤维细胞牙骨质,牙骨质的生物学特征,在生理情况下，牙骨质不像骨组织可以不断地改建和重塑，只有新生，不被吸收，只有在病理情况下才会发生吸收。,四、牙周膜,牙周膜 的细胞,成纤维细胞、巨噬细胞和未分化间充质细胞,成
16、牙骨质细胞和破牙骨质细胞,成骨细胞和破骨细胞,上皮剩余,牙周膜 的功能,支持功能（supportive function）,改建功能（ remodeling function）,感觉功能（ sensory function）,营养功能（ nutritive function）,四、研究骨组织代谢的意义,牙周病,颜面骨组织缺损,牙列缺失和缺损,即刻及延期种植,口腔正畸,颞下颌关节以及根尖病变,骨改建的细胞学基础,第二节,一、成骨细胞（osteoblast）,骨祖细胞（osteoprogenitor cell）,前成骨细胞（preosteoblst）,成骨细胞（osteoblast）,骨细胞(os
17、tocyte),骨衬里细胞(bone-lining cell),（不活跃的成骨细胞）,活动性成骨细胞的胞浆嗜碱性，并具有蛋白合成的细胞结构，如大量的粗面内质网和发达的高尔基体。非活动性成骨细胞似成纤维细胞，扁平状，类似于内皮细胞。,成骨细胞合成与分泌的蛋白主要是I型胶原，其他蛋白有：碱性磷酸酶、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、蛋白多糖、磷蛋白、激素和骨生长因子等。,二、破骨细胞（osteoclast）,破骨细胞的来源,破骨细胞来源于造血系统的单核细胞，与巨噬细胞有共同的前体，在特定条件下融合成多核细胞,破骨细胞的功能,吸收骨、牙本质和钙化的软骨,破骨细胞吸收骨的过程,骨表面附着,细胞极性化,形成封
18、闭区,形成骨吸收陷窝,脱离骨面、转移,破骨细胞的鉴定标准,三、骨细胞（osteocyte）,三、成骨细胞与破骨细胞的关系,成骨细胞参与破骨细胞在骨表面附着的调节,成骨细胞合成破骨细胞骨吸收刺激因子,成骨细胞参与破骨细胞分化成熟的调节,五、牙周韧带细胞,（periodontal ligament cell，PDLC）,牙周韧带细胞具有异质性 ( heterogeneous)。,成骨细胞,成牙骨细胞,牙周韧带细胞,“大胆假设，小心求证。” 胡 适,牙周韧带细胞具有异质性,牙周韧带细胞可能含有干细胞,Figure 1: Isolation of adult human PDLSCs PDL：牙周韧带
19、；PDLSCs：牙周韧带干细胞；DPSCs：牙髓干细胞；BMSSCs：骨髓基质干细胞：STRO-1：干细胞表面标志；CD146/MUC18：干细胞表面标志；GAPDH：内标；Scleraxis：腱细胞的特征转录子,Figure 2: Expression of cementoblastic/osteoblastic phenotype by PDLSCs ALP：碱性磷酸酶；MEPE：基质细胞外蛋白；BSP：骨涎蛋白；OSC：骨钙素；TGFR1： TGF受体；HSP90： assess the amount of protein loaded per sample,Figure 3: Adip
20、ogenic differentiation of PDLSCs Oil red O positive lipid clusters ：脂肪细胞的特征标志之一 PPAR2 ：脂肪细胞的标志 lipoprotein lipase (LPL)：脂肪细胞的标志,Figure 4: Generation of cementum-like and PDL-like structures in vivo by PDLSCs,Figure 5: Generation of collagen fibres by PDLSCs in vivo,Figure 6: PDLSCs in periodontal ti
21、ssue repair in immunocompromised rats,牙周韧带细胞具有异质性,具有纤维细胞表型牙周韧带细胞,PDL：牙周韧带 PDL-L2: 成纤维表型的PDLC MC3T3-E1：成骨细胞系 NIH3T3：成纤维细胞系 C3H10T1/2：间充质细胞系,影响骨改建的生物学因素,第三节,一、骨改建影响因素概论,全身因素（systemic factors）,局部因素（local factors）,其他因素,全身因素,钙调节激素,甲状旁腺素(Parathormone，PTH),1，25-(OH)2维生素D3 ( active vitamin D3 ),降钙素 (Calcito
22、nin， CT),性激素,雌激素（Estrogen）,睾丸激素（Testosterone）,其他,生长激素（growth hormone）,甲状腺激素（Thyroid hormone）,皮质醇激素（Cortisol）,局部因素,生长因子（Growth factors）,白细胞介素Interleukins (IL),肿瘤坏死因子 （Tumour necrosis factors）,干扰素（Interferons）,集落刺激因子 （Colony stimulating factors）,其他,生长因子,胰岛素样生长因子 Insulin-like growth factors (IGF-I & II
23、),转化生长因子-家族 Transforming growth factors (TGFs 1-3),成纤维细胞生长因子 Fibroblast growth factors acidic and basic (aFGF & bFGF),血小板衍生的生长因子 Platelet derived growth factor (PDGF),骨形成蛋白 Bone morphogenetic proteins BMPs 1-7,白细胞介素,IL-1 ,IL-3 (Multi CSF),IL-4,IL-6,IL-8,肿瘤坏死因子,TNF,TNF,IFN,干扰素,集落刺激因子,GM（粒细胞、巨噬细胞）-CSF
24、,M（巨噬细胞）-CSF,前列腺素Prostaglandins,甲状旁腺激素相关肽 Parathyroid hormone related peptide （PTH-RP）,降钙素相关肽 Calcitonin gene related peptide (CGRP),其他（局部）,其他,电刺激 Electrical stimulus,环境因素Environmental,温度,氧水平,酸碱平衡,局部应力 Local stresses,二、第二信使,细胞信号分子包括：短肽、蛋白质、气体分子（NO、CO）以及氨基酸、核苷酸、脂类和胆固醇衍生物等等。,其共同特点是：特异性，只能与特定的受体结合；高效性，
25、几个分子即可发生明显的生物学效应，这一特性有赖于细胞的信号逐级放大系统；可被灭活，完成信息传递后可被降解或修饰而失去活性，保证信息传递的完整性和细胞免于疲劳。,脂溶性信号分子，如甾类激素和甲状腺素，可直接穿膜进入靶细胞，与胞内受体结合形成激素-受体复合物，调节基因表达。,水溶性信号分子，如神经递质、细胞因子和水溶性激素，不能穿过靶细胞膜，只能与膜受体结合，经信号转换机制，通过胞内信使（如cAMP）或激活膜受体的激酶活性（如受体酪氨酸激酶），引起细胞的应答反应。所以这类信号分子又称为第一信使（primary messenger），而cAMP这样的胞内信号分子被称为第二信使（secondary m
26、essenger）。,目前公认的第二信使有cAMP、cGMP、三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG），Ca2+,第二信使的作用：转换和放大的作用。,cAMP 和 IP3 均属于G蛋白耦联受体所介导的细胞信号通路,激素G蛋白耦联受体G蛋白腺苷酸环化酶cAMP依赖cAMP的蛋白激酶A基因调控蛋白基因转录,cAMP传导途径,IP3传导途径,胞外信号分子与细胞表面G蛋白耦联型受体结合，激活质膜上的磷脂酶C（PLC-），使质膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG）两个第二信使，胞外信号转换为胞内信号（图8-21）,三、骨改建的调节因子,骨塑形（
27、bone modeling）和骨改建（bone remodeling）,成骨细胞系和破骨细胞系间的交互作用,间充质干细胞,前成骨细胞,前破骨细胞,成骨细胞,破骨细胞,PTH PTH-RP PG Cytokine Vitamin D3,骨基质 溶解,BMP-2 FGF IGF-1 IGF-2 TGF-1 TGF-2,MCSF,RANKL,RANK,cfms,PTH作用的总效应是升高血钙。,PTH具有促进成骨和溶骨的双重作用。实验研究表明小剂量PTH可促进成骨作用，而大剂量则可促进溶骨作用。,甲状旁腺素 PTH,成骨细胞,IGF-1,FGF-2,间充质干细胞,前成骨细胞,成骨细胞,骨衬里细胞,PT
28、H-RP,刺激成骨细胞功能,阻止成骨细胞凋亡,Bcl-2 Bcl-XL,PTH,PTHRI,1，25-(OH)2维生素D3,1，25-(OH)2维生素D3总的调节效果是使血钙、血磷增高。,对骨亦有溶骨和成骨的双重作用。,作用与PTH相反，其作用是抑制破骨作用，抑制钙、磷的重吸收，降低血钙和血磷。,降钙素 CT,直接抑制破骨细胞的生成，抑制骨盐溶解、降低血钙、血磷浓度。,雌激素,对成骨细胞和破骨细胞均有作用，抑制骨盐溶解，促进成骨。,睾丸激素,对骨形成直接的促进作用，并且通过促进肌肉生长间接促见骨形成,可在脂肪细胞里转化为雌激素,雌激素,破骨细胞,雌激素受体,TGF-,促使细胞凋亡,单核细胞,前
29、破骨细胞,前破骨细胞,雌激素衰竭的骨,雌激素富集的骨,IL-1 ,IL-1 ,IL-1 受体,IL-1 受体,IL-1 伪受体,IL-1 和受体结合 促进破骨细胞形成,破骨细胞形成,雌激素,成骨系细胞,TGF-,破骨系细胞,破骨细胞 分化继续,阻止破骨 细胞分化,RANKL,OPG,RANKL + RANK,RANKL +OPG,胰岛素样生长因子,促进成骨细胞增值，诱导成骨细胞分化。,转化生长因子-家族,作用比较复杂、多变,促进成骨细胞增值、分化。,抑制IL-1和维生素D3 诱导的骨吸收和破骨细胞的成熟分化,成纤维细胞生长因子,促进间充质细胞、前成骨细胞增值，不诱导成骨细胞分化。,血小板衍生的
30、生长因子,可以增加间充质细胞IGF的合成，对骨作用机理不清,骨形成蛋白,目前已知的唯一可以独立在体内异位成骨的生长因子,肿瘤坏死因子,通过成骨细胞的介导，具有明显的促进骨吸收的作用。,干扰素,可抑制前破骨细胞的增生、分化，从而抑制破骨细胞性骨吸收，是一种多功能的细胞因子，又是骨吸收抑制因子。,IL,IL-1，是骨吸收的有效的强力刺激因子，它可以刺激成骨细胞产生PGE2，介导骨吸收，还可刺激成纤维细胞与吞噬细胞产生胶原酶，活化破骨细胞而促进骨吸收,IL-2可以通过刺激破骨细胞分泌促进骨吸收,IL-6为多功能的细胞因子，是介导破骨细胞性骨吸收的中心因子，具有显著促进骨吸收的作用。,集落刺激因子,M
31、-CSF是破骨细胞分化过程中不可缺少的因子,前列腺素,通过增加cAMP含量促骨吸收,几乎所有促进或抑制骨吸收的细胞因子均影响PG的合成。,对成骨细胞的作用具有双向性。,四、牙周韧带细胞的调节因子,刺激增殖,诱导分化,刺激蛋白质的合成和分泌,促进附着,改变细胞形状,刺激细胞移动,血小板衍生的生长因子,调控细胞增殖，但对细胞外基质的合成和间充质细胞的分化没有作用。,胰岛素样生长因子,促进前成骨细胞增值，诱导成骨细胞分化。但对间充质细胞的分化和组织的血管化没有作用。,转化生长因子-,作用比较复杂、多变；,促进/抑制成骨细胞增值、分化。,碱性成纤维细胞生长因子,抑制牙周韧带细胞形成矿化结节。,骨形成蛋
32、白,可以促进牙槽骨、牙骨质以及牙周韧带样结构的形成。,力在骨改建中的作用,第四节,颅面骨组织变化研究的 主要方法,第五节,口腔微生物分子生物学,武汉大学口腔医学院 边 专,什么是遗传物质？,蛋白质 20种氨基酸 DNA 四种碱基,转化实验的结果说明,生命的主要遗传物质,脱氧核糖核酸（DNA）,DNA结构的推衍,Chargaff: T+C=A+G A=T G=C X线衍射： DNA在两条链组成，相互平行,核酸的组成,DNA RNA 脱氧核糖 核糖 腺嘌吟 胞嘧啶 腺嘌呤 胞嘧啶 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 尿嘧啶 双链 单链,DNA复制,半保留复制,DNA复制,半不连接复制 由于DNA多聚酶只能从
33、5 3方向合成DNA，因而半保留复制不能完全解释。,DNA复制的特点,新合成的子代DNA与亲代DNA完全一样，保证了遗传的稳定性。,RNA,信使RNA（mRNA) 核蛋白体RNA（rRNA) 转运RNA（tRNA),RNA的生物合成转录,以DNA为模板合与RNA 由RNA多聚酶合成 从DNA上特定起始序列（启动子）开始，至终止信号结束,蛋白质的生物合成翻译,遗传密码 由3个连续的核苷酸组成,蛋白质的生物合成翻译,蛋白质合成过程 .氨基酸活化 .蛋白质合成的起始 AUG甲酰化甲硫氨酸（fMet) .蛋白质合成的终止 终止码UAA、UGA、UAG,蛋白质的生物合成翻译,新生多肽的加工 . fMet
34、水解 . 磷酸化、糖基化、甲基化修饰 . 信号肽 蛋白质向细胞外分泌,基因表达,DNA RNA蛋白质,丰富的生命现象,基因表达的调节,机体的每一个细胞都有一套完全相同的基因 共同表达的基因 特异性表达的基因,基因表达的调节,共同表达的基因 维持细胞基本结构、功能,基因表达的调节,特异性表达的基因 红细胞产生血红蛋白 B淋巴细胞产生抗体 成牙本质细胞分泌牙本质蛋白,基因表达调控的原因动力,细胞内、细胞间，或细胞与外界环境间关系的变化。,基因表达调节的方式,启动子 强启动子与RNA多聚酶有较强的结合能力，转录水平较高；弱启动子则反之。,基因表达调节的方式,调节蛋白的作用 负向调节 正向调节,负向调
35、节,乳糖操纵子学说,正向调节,原核生物基因表达的调节,主要在转录水平,真核基因生物调节,多层次 复杂性,分子克隆技术,限制性内切酶,特定的识别序列，46个碱基对 在识别序列内固定位置切割，5 端磷酸基因， 3-端羟基基团 切割后形成粘性或平滑末端,DNA连接酶,催化DNA中相邻3羟基和5 磷酸基团之间形成3 ，5 磷酸二酯键。,质 粒,细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制 其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达 分子200050000bp,T,pGEM-T Vector (3003bp),Ampr,lacZ,ori,XmnI 1994,ScaI 1875,NaeI 2695,A
36、paI AatII SphI BstZI NcoI SacII,T7,SpeI NotI BstZI PstI SaLI NdeI SacI BstXI NsiI,SP6,T,1 start 14 20 26 31 37 46,55 62 62 73 75 82 94 103 112 126,pGEM-T vector map,XhoI SmaI,XhoI,SmaI,XhoI,SmaI,pCI,pCIA-P,pGEM-T/A-P,A-P fragment,Sub-cloning construction of recombinant pCIA-P insertion of A-P DNA fr
37、agment into plasmid pCI,XhoI,SmaI,T4 Ligase,A-P fragment,构建质粒的特点,Ori区：复制起点 Par区：保证质粒均匀分布于子细胞 多克隆区：人为构建，便于克隆操作 选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选,接 合,在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的单向转移。 雄性菌：含F性因子，染色体外环状DNA,转 化,外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。,转 录,利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受体菌内的现象，能在自然状态下发生。,分子克隆常用技术,DNA
38、电泳 基因转移 核酸杂交 聚合酶链反应PCR,DNA电泳,可分离不同分子量的DNA,Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder,对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析 Lane 17: 临床菌株S. sobrinus; Lane 814:临床菌株 S.mutans.,(Kb),2.0 1.0 0.25 0.1,0.75 0.5,MW,核酸杂交,原理： 在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离 在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股,Southern Blot,电泳、转移、杂交 确定分子量,斑点杂交,目标序
39、列的存在 目标序列的量,聚合酶链反应PCR,与龋病相关微生物的定量检测方法,细菌形态 生化反应 免疫反应 分子生物学方法 -分子探针杂交 -RFLP -PCR,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,在人类口腔中检出率很高 茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切,变形链球菌和茸毛链球菌,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,套式PCR快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌. 谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵. 中华口腔医学杂志，2003，38：223-226,唾液在与龋病相关微生物检测中的应用,套式PCR(Nested PCR ),5,3,Template,Outer primer
40、2,Outer primer1,The first PCR,5,3,Inter primer2,Inter primer 1,Next template,The second PCR,5,3,The second PCR product,本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物（outer primer,inter primer）,抽提细菌染色体DNA(Igarashi et al.1996) -细菌 -唾液 PCR反应过程 第一次PCR反应 预变性: 94 4min 变性: 94 1min 退火: 51 1min 30cycles 延伸
41、: 72 2min 最后延伸: 72 5min 第二次PCR反应,a b c d e f g h Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8,选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析 以变链菌组 (Mutans Streptococci)染色体 DNA为模板 Lane 1: S.cricetus AHT; 2.S. rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt; 4. S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7; 6. S.mutans OMZ175; 7. S.sobrinus 6715; 8. S.downei Mfe28.,MW (Kb
42、)2.0 1.0 0.25 0.1,0.75 0.5,a b c d e f g h Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8,选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析 Lane 1: S.cricetus AHT; 2.S. rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt; 4. S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7: 6. S.mutans OMZ175; 7. S.sobrinus 6715; 8. S.downei Mfe28. Marker: DL2,000 Ladder,MW (Kb)2.0 0.75 0.5,1.0,0.2
43、5,0.1,Ladder 1 2 3 4 5 6,第一次PCR的灵敏度 变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量 Lane1: 108 CFU; Lane 2: 107 CFU; Lane3: 106CFU; Lane 4:105 CFU,MW,(Kb),2.0 0.75 0.5,1.0,0.25,2.0 0.5,Ladder 1 2 3 4 5 6,1.0 0.75,0.25,MW (Kb),第二次PCR的灵敏度 变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量 Lane 1: 104 CFU, Lane 2: 103 CFU,Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9
44、 10 11 12 13 14 Ladder,对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析 Lane 17: 临床菌株S. sobrinus; Lane 814:临床菌株 S.mutans.,(Kb),2.0 1.0 0.25 0.1,0.75 0.5,MW,A,B,Lane1.chromosomal DNA from S.mutans Ingbritt; 2.chromosomal DNA from S.sobrinus 6715; 3.saliva sample from subject A; 4.saliva sample from subject B; 5.saliva sample
45、 from subject C.,利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌S.mutans和茸毛链球菌S.sobrinus(图A)利用外引物(图B)利用内引物,分子克隆的主要步骤,基因文库的建立 目的基因的筛选 目的基因的分析,原核生物基因文库的建立,提取细胞DNA 限制性内切酶酶切 DNA片段连接至质粒或噬菌体 转化宿主细胞（大肠杆菌）,目的基因的筛选,核酸杂交 免疫学检测,目的基因的分析,DNA序列 启动子分析 推测蛋白质一级结构 推测蛋白质二级结构,口腔生物学,Oral Biology,武汉大学口腔医院 李成章, 基础学科 新兴学科 80年代始于一些发达国家 90年代初国内开展,前言,口
46、腔生物学,学科涵盖,口腔生物学,学科意义,桥梁课程 上下追朔 开拓视野 融会贯通 产生思想 促进发展,口腔生物学,口腔免疫学 Oral Immunology,非特异性免疫,生来具有，作用无针对性 生物性屏障结构 * 吞噬细胞 * 抗微生物物质 * 天然免疫系统中存在着独特的特异性,口腔免疫体系,特异性免疫,后天获得，作用具有抗原针对性 体液免疫-B细胞介导 细胞免疫-T细胞介导,口腔免疫体系,人体粘膜免疫系统,器官性粘膜相关淋巴组织 （Organized mucosa-associated lymphoid tissue O-MALT） 弥散性粘膜相关淋巴组织 （Diffuse mucosa-associated lymphoid tissue D-MALT）,口腔免疫学,口腔免疫学,口腔免疫体系 菌斑免疫 口腔常见病免疫,口腔生物学,口腔免疫体系 (免疫角度),非特异性免疫 特异性免疫,口腔免疫体系 (组织学角度),口外淋巴结 口咽淋巴组织环 固有口腔屏障,口外淋巴结,耳后淋巴结,枕淋巴结,颈前淋巴结,锁骨上淋巴结,腮腺淋巴结,颊淋巴结,下颌下淋巴结,骸下淋巴结,口腔免疫体系,TB定居增殖场所 产生Ab致敏LC 部位 免疫应答场所,外周免疫器官 *,口咽淋巴组织环,腭扁桃体 palatine tonsils 舌扁桃体 lingual tonsils 咽扁桃体 phar