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1、第十六章 RNA的生物合成 （转录）,RNA Biosynthesis，transcription,定义： 在RNA聚合酶的催化下，生物体以 DNA为模板合成RNA的过程。 转录产物: mRNA, rRNA, tRNA等,转录的选择性： 不对称转录(asymmetric transcription),结构基因：能转录出RNA的DNA区段,不对称转录 在特定的生长发育阶段，转录只在某些DNA 区段进行 DNA双链中仅有一条单链可作为模板指导转 录的进行 ,且模板链并非总在同一条单链上,RNA生物合成体系,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶: RNA聚合酶
2、 (RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子,第一节 转录的模板和酶,1.模板 (template) 模板链 (template strand) 编码链 (coding strand),2. RNA聚合酶 (DNA dependent RNA polymerase, RNA-pol) a.原核生物的RNA聚合酶 (以E.coli为例) 2 (核心酶,core enzyme)： 2 (全酶,holoenzyme) 亚基：辨认转录起始点 特异抑制剂: 利福平,催化NTP按模板的指引合成RNA,b.真核生物的RNA聚合酶 RNA-pol : 45S-rRNA RNA-pol
3、: hnRNA, lncRNA, piRNA, miRNA RNA-pol : 5S-rRNA,tRNA,snRNA 特异抑制剂: 鹅膏蕈碱,真核生物RNA聚合酶的亚基组成,各有2个不同的分子量超过100 kD的大分子量的亚基 都含有多个小分子量的亚基 某些小分子量的亚基相同，可同时出现在两种或三种酶上,3. RNA聚合酶辨认结合DNA模板的启动子 原核生物的转录单位: 操纵子(operon),TTGACA,TATAAT,Pribnow Box,5,3,3,5,RNA-pol辨认位点 (recognition site),RNA聚合酶保护法,转录过程,起始 (initiation) 延长 (e
4、longation) 终止 (termination),第二节 原核生物的转录过程,转录起始 (Initiation) 需要解决两个问题: RNA聚合酶必须准确的结合在转录模板 的启动序列区域 DNA双链解开，其中的一条单链作为转 录模板,转录起始过程: 形成闭合转录复合体：全酶靠亚基识别结合启动序列的-35区, 形成闭合的全酶-DNA复合物 DNA双链打开(开放转录复合体)：全酶随即滑动至-10区，在亚基的作用下，启动序列区域的DNA双链迅速打开，形成开放转录复合体。 转录起始复合物形成：在转录起始点，RNA聚合酶催化发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。, (sigma subunit)
5、 allows RNA polymerase to recognize and bind specifically to promoter regions.,E. coli RNA polymerase + subunit,转录起始复合物,5pppGpN-OH3,转录延长 a. 转录延长的化学反应,RNA聚合酶的反应机制,mRNA,mRNA,b. 转录空泡 (transcription bubble),转录终止 (termination) （1）依赖Rho因子的转录终止 （2）非依赖Rho因子的转录终止,（1）依赖Rho因子的转录终止,a. Rho works by chasing RNA p
6、olymerase and knocking it off the template b. This is an active process that requires the hydrolysis of ATP.,依赖Rho因子的转录终止模式： 1.Rho因子辨认结合新生RNA链上的Rho因子识别位点，借助水解ATP获得的能量推动其沿着RNA链由5-3端移动到达RNA聚合酶区域，并使RNA聚合酶构象发生变化而停顿； 2.Rho因子利用其解螺旋酶的活性在ATP供能的情况下，使DNA：RNA杂化双链解离，从而使RNA链和RNA聚合酶从转录复合物上脱落下来，转录过程随即终止。,（2）非依赖Rho
7、因子的转录终止,非依赖Rho因子的转录终止模式： 1.当RNA链延长至接近终止区时，该区域附近的转录产物形成特殊的茎环结构，阻止RNA聚合酶继续向前移动，并促进转录复合物的解体； 2.茎环结构末端的一段寡聚U与DNA链之间形成的U-A配对极不稳定，亦有助于RNA链从转录复合物上脱落,Termination (6-7),Phases of RNA Synthesis,转录过程,起始 (initiation) 延长 (elongation) 终止 (termination),第三节 真核生物的生物合成,转录延长,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方
8、向,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA, 和转录后修饰密切相关,转录终止,第四节 真核生物RNA的加工 （Eukaryotic post-transcriptional modification）,几种主要的修饰方式:,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 修饰(modification),4. 添加(addition),真核生物mRNA的转录后加工 1. 5 帽子结构 2. 3 poly (A) 尾巴 3. mR
9、NA剪接 (mRNA splicing) 4. mRNA编辑 (mRNA editing),1. 5 帽子结构(m7GpppG),(G),7-甲基鸟苷酸,加帽过程需要加帽酶和 甲基转移酶的参与。,5 pppGp,帽子结构的生成,帽结构的作用 对mRNA的5/-端起保护作用，避免酶解 在蛋白质合成中促进mRNA翻译,2. 3 poly (A) 尾巴,poly A尾不是模板编码，基因中没有相应序列，转录生成 的mRNA在核内以ATP为底物，在poly A聚合酶催化下逐个加上去，形成poly A尾结构。 真核细胞内mRNA的poly A可长达100-200个腺苷酸。 5/ m7GpppG 3/ AA
10、AAAAAAAAA poly A尾的作用： 增加mRNA自身的稳定性 维持mRNA翻译模板的活性,3/-端多聚腺苷酸(poly A)尾的形成：,3. mRNA 剪接,断裂基因(split gene) 真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，这些基因称为断裂基因。 编码区：外显子 (exon) 非编码区：内含子（intron）,a. 剪接信号,3. mRNA的剪接机制, U1snRNP和U2snRNP分别结合在内含子的3和5末端, U4、U5、U6加入，形成剪接体，内含子弯曲形成套索状，E1、E2距离拉近, U2和U6形成催化中心，发生转酯反应，即磷酸二酯键的转移反
11、应,U2,pG-OH (ppG-OH, pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应 (twice transesterification),U1-snRNA,U2-snRNA, RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,4. mRNA的编辑(mRNA editing)：转录后mRNA上的修饰和加工使其携带的遗传信息发生改变,补：内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因； II：也发现于线粒体、叶绿体，转
12、录产物是mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,真核生物tRNA的转录后加工,tRNA前体,连接酶,tRNA核苷酸转移酶,ATP,ADP,碱基修饰,真核生物rRNA的转录后加工,四膜虫rRNA的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,核 酶 (ribozyme): 具有酶促活性的分子。一般是指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的RNA分子。,1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的
13、RNA”时，没有人予以注意。 20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。,核酶的发现,1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。,1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度Mg2+存在下，留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶相同的催化活性。 1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。,1995年
14、6月，Cuenoud等设计了具有连接酶活性的DNA分子，它能够催化两个DNA片段的连接。 同年10月，Usman等人化学合成了一个由14个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA片段，能够较弱地水解RNA磷酸二酯键。,利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段，称为酶性DNA，又称脱氧核酶,T.Cech的研究工作:,研究目的：细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来的。根据过去传统的概念，这一过程必须要有蛋白质酶来完成。 研究对象：四膜虫，其含有一种rRNA前体，其组成中除了核糖体RNA的固有序列
15、外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列（interveningsequence，IVS）。,重要发现开始于1981年,研究发现： a.转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的，称为自我剪接。 b. IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键。,rRNA前体能靠自己完成剪接过程。在一定条件下rRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，然后把保留的rRNA部分的末端连接起来。即它是可以催化自有底物切割的具有酶活性的RNA。 RNA分子具有
16、自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应。,研究目的：t-RNA分子的剪接过程 研究发现： 在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核糖核酸酶P （RNase P）中的 RNA能够切割tRNA前体的5端。,S.Altman的研究工作,核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白, 含有一个单链RNA分子, 长度为375个碱基，结合一个相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基)。,过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。 而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。,(Thomas Robert Cech),(S
17、idneyAltman),核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。,最简单的核酶二级结构槌头状结构 (hammerhead structure),底物部分,通常为60个核苷酸左右 同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子 细线表示天然的核酸分子 X 表示一致性序列 箭头表示切断点,（一）应用于生命起源的研究,核酶的应用,生命的起源？ 新的观点：生命从RNA开始 目前已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这
18、些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。,（二）在医学领域中的应用,经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子，从而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强； 利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷； 免疫源性低，很少引起免疫反应； 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。,核酶技术面临的问题,核酶催化切割反应的可逆性问题 提高催化效率 寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 使核酶在细胞内有调控地高效表达 增强核酶在细胞内的稳定性 对宿主的损伤问题有待进一步考察
19、, 转录是基因表达的重要环节,转录产物进 一步参与和调控基因表达(翻译环节),DNA,RNA,Protein,转录,翻译,转录具有十分重要的生物学意义,科恩伯格 59岁,美国斯坦福大学医学院 研究领域: 真核生物转录的分子基础 科恩伯格的研究揭示了真核生物体内的细胞如何利用基因内存储的信息合成蛋白质，而人类的多种疾病如癌症、心脏病等都与这一过程发生紊乱有关,2006年诺贝尔化学奖得主科恩伯格,总 结 1. 复制和转录的区别,2.几个定义 模板链、编码链、不对称转录、断裂基因、 剪接体、核酶 3.几个问题 (1)原核生物RNA聚合酶的组成及功能 (2)原核生物RNA聚合酶与模板的辨认结合过程 (3)原核生物的转录过程 (4)真核生物mRNA的转录后加工过程,大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶,