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1、微生物转化井冈霉素制备假氨基糖类-糖苷酶抑制剂的研究,1,主要内容,一. 绪论及立体依据 二. 井冈胺标准品的制备及其分析方法的研究 三. 井冈胺转化菌株的筛选 四. 菌株的分类鉴定 五. 液体发酵工艺的优化 六.结论、展望及致谢,3,一.绪论及立题依据,1.1糖尿病概述 由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，伴有因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常。,一.绪论及立题依据,一.绪论及立题依据,型DM的主要致病机制是组织对胰岛素抵抗(insulin resistance，IR),一.绪论及立题依据,一.绪论及立题依据,1.2.糖尿病的治疗药物及其作用原理,一.绪论及立题依
2、据,一.绪论及立题依据,按照-糖苷酶的来源不同，可将其分为微生物发酵来源、植物来源和食物来源三类。,1.3.-葡萄糖苷酶抑制剂的来源及分类,一.绪论及立题依据,-糖苷酶抑制剂的抗HIV功能 使HIV包膜糖蛋白前体因在内质网内进行N-糖基化时发生错误折叠而停留在内质网，干扰病毒的组装 -糖苷酶抑制剂与肿瘤 血管瘤的生成需要特定的细胞寡糖，抑制剂改变内细胞上与之相关的某些结构，有抑制肿瘤生长的可能,1.4.-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展,一.绪论及立题依据,井冈霉素(Jinggangmycins)又被称为有效霉素(validamycins)，是上海农药研究所沈寅初等于1972年开发出的一种农用抗生素
3、，由从我国井冈山地区土壤中分离的微生物吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces. hygroscopicus var. jinggangensis)代谢产生,1.5.井冈霉素与-糖苷酶抑制剂,一.绪论及立题依据,一.绪论及立题依据,一.绪论及立题依据,一.绪论及立题依据,新型降糖药物的开发 微生物水解井冈霉素生产井冈胺 井冈胺制备、分离纯化及检测方法的建立 首次发现芽孢杆菌Bacillus oleronius 水解井冈霉素 为中试发酵提供了实验基础,1.6.本文的研究意义,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,2.1井冈胺标品的制备,3g阿卡波糖+3gNaOH100回流48h中和，离心
4、732阳离子树脂氨水洗脱DOWEX 12阴离子树脂纯水洗脱，减压浓缩0.1g井冈胺,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,2.2 所制井冈胺的结构鉴定(LCMS ),二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,2.3.1 井冈胺的TLC检测 展开剂A ：乙酸乙酯：乙酸：水=3:1:1 展开剂B ：正丁醇：乙醇：水：吡啶=35:15:40:10 展开剂C ：正丙醇：乙酸：水=4:1:1,2.3 井冈胺分析方法发的确立,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,2.3.2.1 衍生化反应条件的确立,2.3.2井冈胺的HPLC检测,溶剂体系：井冈胺+1%对
5、氟硝基苯+1.5%三乙胺+二甲基甲酰胺 反应方式：水浴 反应温度：70，80，90，100 反应时间：20min， 30min， 40min， 50min， 60min， 70min， 80min，,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,反应温度对衍生化结果的影响,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,反应时间对衍生化结果的影响,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,2.3.2.2 井冈胺HPLC条件的确立 不同色谱柱对转化产物衍生物分离效果的影响,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,不同流动相比例对转化产物衍生物分离效果的影响 流动相A ：乙腈：水=12：:88 流动相B
6、：乙腈：水=15：:85 流动相C ：乙腈：水=17：:83,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,不同柱温、流速对转化产物衍生物分离效果的影响,二.井冈胺标准品的制备及其分析方法的建立,2.4 小结 732阳离子交换树脂和DOWEX 12阴离子交换树脂联用可以很好的从水解液中分离并纯化出井冈胺。水解产物经鉴定后确定为井冈胺。 对影响衍生化反应结果的温度、反应时间两个因素做了初步研究。 确立的井冈胺的TLC和HPLC分析方法，分离效果良好。,三. 井冈胺转化菌株的筛选,3.1 实验流程 采集土样（上海市奉贤区海湾镇农田及崇明县建设镇稻田 ） 土样优选 微生物初筛（TLC） 复筛（HPLC）
7、 菌株鉴定（形态学、生理生化、分子生物学）,三. 井冈胺转化菌株的筛选,三. 井冈胺转化菌株的筛选,3.2 土样优选 液体筛选培养基：井冈霉素15g，硫酸铵10g，硫酸氢二钾7g，硫酸二氢钾3g，无水硫酸镁0.1g，水1000ml。,细菌细菌59株，真菌23株 （V1-V82）,三. 井冈胺转化菌株的筛选,3.3 初筛,三. 井冈胺转化菌株的筛选,3.4 复筛,三. 井冈胺转化菌株的筛选,3.5 菌体形态,三. 井冈胺转化菌株的筛选,三. 井冈胺转化菌株的筛选,三. 井冈胺转化菌株的筛选,3.6小结 井冈霉素作为唯一碳源的培养基，省时、高效 细菌菌落形态、大小、颜色非常类似，无法利用形态学方法
8、区分 。实际菌株数量可能较少 经历菌体-芽孢-再次萌发菌体的过程 芽孢杆菌分解井冈霉素产井冈胺属首次发现,四. 菌株的分类鉴定,四. 菌株的分类鉴定 4.1 实验流程 分子生物学鉴定：DNA抽提电泳检测 PCR扩增产物测序BLAST对比及进化关系分析 生理生化检测：考察菌株Vali-2的革兰氏染色情况，菌株产生淀粉酶、蛋白酶、过氧化氢酶的能力以及菌株分解硝酸盐、柠檬酸盐和葡萄糖等11项指标与文献对比,四. 菌株的分类鉴定,4.2 测序结果及BLAST对比,四. 菌株的分类鉴定,4.3 进化树分析,比对序列后判断样本为Bacillus sp.，其中Bacillus oleronius strai
9、n可能性较高,四. 菌株的分类鉴定,4.4 生理生化检测,四. 菌株的分类鉴定,4.5 小结 VP实验结果重现性差 ，可能与菌龄、试剂pH不同等因素有关，这与文献报道中相一致 。 菌体生长规律与芽孢杆菌降解石蜡油的过程中，菌体形态在营养细胞和芽孢体间的相互转变规律相一致。 Bacillus oleronius于1995年首次分离纯化得到，并未收录在任何已知细菌鉴定手册中 有关芽孢杆菌Bacillus oleronius的文献报道很少， 其理化性质有待进一步实验完善,五. 液体发酵工艺的优化,五. 液体发酵工艺的优化 考察因素：培养基种类、发酵时间、发酵温度、底物浓度、最适pH、装液量、接种量
10、考察方法：单因素法+各最佳水平复核,A： 酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，井冈霉素15g，磷酸氢二钾7g，硫酸二氢钾3g，无水硫酸镁0.1g，水1000ml。 B：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，井冈霉素15g，水1000ml。 C： 酵母浸粉5g，蛋白胨10g，井冈霉素15g，磷酸氢二钾7g，硫酸二氢钾3g，无水硫酸镁0.1g，水1000ml。 D： 井冈霉素15g，硫酸铵10g，磷酸氢二钾7g，硫酸二氢钾3g，无水硫酸镁0.1g，水1000ml。 E： 葡萄糖10g，硫酸铵10g，井冈霉素15g，磷酸氢二钾7g，硫酸二氢钾3g，水1000ml。,五. 液体发酵工艺的优化,五. 液体发酵工艺的优化,5.2 发酵终点的确立,五. 液体发酵工艺的优化,5.3最适初始pH的确定,五. 液体发酵工艺的优化,5.4 最适装液量,五. 液体发酵工艺的优化,5.5 最适接种量,五. 液体发酵工艺的优化,5.6 最适底物（井冈霉素）浓度,五. 液体发酵工艺的优化,5.7 最适发酵温度的确定,五. 液体发酵工艺的优化,5.8 各因素最佳水平的验证 在发酵培养基C、发酵时间5d、发酵液初始pH=8、装液量50ml、接种量15%、井冈霉素浓度1%、发酵温度34，这一发酵工艺下井冈胺的产量和转化率如下：,