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1、Welcome to My Molecular Biology Class,Yang Yang（杨洋 教授） Huazhong University of Science and Technology,Molecular Biology of the Gene, 5/E - Watson et al. (2004),Part I: Chemistry and Genetics Part II: Maintenance of the Genome Part III: Expression of the Genome Part IV: Regulation Part V: Methods,Part
2、 II: Maintenance of the Genome,Dedicated to the structure of DNA and the processes that propagate, maintain and alter it from one cell generation to the next,CHAPTER 3: The replication of DNA (DNA的复制）,The revised central dogma,Translation,RNA processing,DNA repair,基因组的保持,基因组的表达,1. The Chemistry of D
3、NA Synthesis(DNA合成的化学基础） 2. The Mechanism of DNA Polymerase（DNA聚合酶的作用机制） 3. The Specialization of DNA Polymerases（DNA聚合酶的特化） 4. The Replication Fork（复制叉） 5. DNA Synthesis at the Replication Fork（复制叉上的DNA合成） 6. Initiation of DNA Replication（复制的起始） 7. Binding and Unwinding（结合和解旋） 8. Finishing Replicat
4、ion（复制的终止）,Outline,The first part describes the basic chemistry of DNA synthesis and the function of the DNA polymerase,1. The Chemistry of DNA Synthesis,1 DNA synthesis requires deoxynucleoside triphosphates and a primer:template junction （DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物-模板接头）,DNA合成必须具备的两个关键底物： 四种脱氧核苷三磷酸-dATP, d
5、GTP, dCTP, dTTP 2. 引物-模板接头（ primer:template junction）,Substrates required for DNA synthesis,2-脱氧核糖核苷三磷酸,退火引物,DNA的生长末端,模板链,1.2 DNA is synthesized by extending the 3 end of the primer (DNA通过引物3端的延伸进行合成）,DNA合成由掺入dNTP 的-磷酸的亲核攻击 引发，导致引物3端 延伸一个核苷酸，并 释放一个焦磷酸,1.3 Hydrolysis of pyrophosphate (PPi) is the dri
6、ving force for DNA synthesis （焦磷酸水解是DNA合成的驱动力）,2. The mechanism of DNA Polymerase (Pol) （DNA聚合酶的作用机制）,2.1 DNA Pol use a single active site to catalyze DNA synthesis （DNA聚合酶用一个活性位点催化DNA的合成）,A single site to catalyze the addition of any of the four dNTPs （DNA聚合酶用一个活性位点来催化任意4种脱氧核苷三磷酸的添加） Recognition of
7、 different dNTP by monitoring the ability of incoming dNTP in forming A-T and G-C base pairs（DNA聚合酶监视引入核苷酸形成A-T或G-C碱基对的能力，而不是检测进入活性位点的是何种核苷酸） 只有在形成正确碱基对的情况下，引物的3-羟基和在最佳催化位置上的引入核苷三磷酸的-磷酸才能发生催化反应 Incorrect base pair dramatically lowers the rate of catalysis（错误核苷酸掺入的速率是碱基配对正确时掺入速率的1/10000）,Distinguishi
8、ng different dNTPs: kinetic selectivity,不正确的A-A碱基配对使引入核苷酸的-磷酸错位，极大地降低了 催化速率，导致DNA聚合酶优先添加正确配对的dNTP,Distinguishing between rNTP and dNTP by steric exclusion of rNTPs from the active site (空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP-核糖核苷三磷酸） DNA聚合酶对核糖核苷三磷酸与脱氧核糖核苷三磷酸显示出令人惊异的分辨能力 虽然细胞中rNTP比dNTP浓度要高10倍，但它们掺入的速率却是dNTP的1/1000,2
9、.2 DNA Pol resemble a hand that grips the primer-template junction (DNA聚合酶像手掌一样握住引物-模板接头）,Thumb,Fingers,Palm,DNA聚合酶的3个结构域：拇指，手指，手掌,（拇指）,（手指）,（手掌）,Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs and one for removal of the mispaired dNTP. The polymerization site: (1) binds to two metal ions（Mg
10、2+, Zn2+) that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis（结合2个二价金属离子，可以改变正确碱基配对的dNTP和3-羟基周围的化学环境） (2) Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides (检查最新加入的碱基配对的准确性，错误配对使催化活性显著降低，使引物-模板接头从聚合酶活性位点上脱离下来，并结合到聚合酶上的一个独立的具有校对功能的核酸酶的活性
11、位点上） 3. Exonuclease site/proof reading site（校对功能，外切核酸酶活性位点）,DNA Polymerase-palm domain(手掌域）,Binds to the incoming dNTP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis（手指域中的几个残基可以和引入的dNTP结合，一旦形成正确的碱基配对后，手指域即发生移动，包围住dNTP） 这种闭合形式可以使引入的核苷酸与催化性的金属离子密切接触，从而促进催化反应 手指域还与模板区结合，使模板的磷酸二酯键骨架在活性部
12、位后立即产生约90度的回折。此弯曲仅使催化位点上引物后的第一个模板碱基暴露,DNA Polymerase-finger domain（手指域）,Thumb,Fingers,Palm,（拇指）,（手指）,（手掌）,模板上的弯折,模板碱基,模板,引物,Not directly involved in catalysis Interacts with the synthesized DNA （与最新合成的DNA相互作用） maintain correct position of the primer and the active site（维持引物及活性部位的正确位置） maintain a str
13、ong association between DNA Pol and its substrate（维持DNA聚合酶与其底物之间的紧密连接）,DNA Polymerase-thumb domain（拇指域）,2.3 DNA Pol are processive enzymes（ DNA聚合酶是一种延伸酶）,DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力（催化是快速的，每秒添加1000个核苷酸） Processivity（延伸能力） is a characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates（酶处理多聚体底物的一种特性
14、） The processivity of DNA Pol is the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction （ DNA聚合酶的延伸能力定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平均数） 每个DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，范围从每次结合后时仅几个核苷酸到5000多个碱基,The rate of DNA synthesis is closely related to the polymerase processivity, because t
15、he rate-limiting step is the initial binding of polymerase to the primer-template junction （聚合酶与引物-模板接头的最初结合是限速步 骤，一旦结合后核苷酸的添加就非常迅速了） 高延伸性的聚合酶与一个完全非延伸性的酶相比， 其DNA合成的整体速率可高出1000倍,假设的非延伸性DNA聚合酶,延伸性DNA聚合酶,添加1个dNTP 然后释放下来,延伸性的DNA聚合酶与 模板结合一次，就能 添加很多dNTP,2.4 Exonucleases proofread newly synthesized DNA（外切核
16、酸酶负责校正新合成的DNA),仅仅依靠碱基配对的几何学和碱基间互补性的系统，无法达到细胞内观察到的极高的DNA合成精确度（约每添加1010个碱基对产生一个错误） 影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基偶然变换成“错误”的互变异构体（亚氨基或者烯醇） 碱基的这种变构体使不正确的碱基对可以位于催化中正确的位置。校正作用可以纠正这种错误 DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实现的 The mismatched dNMP is removed by proofreading exonuclease（校正外切核酸酶）, a part of the DNA polymerase（DNA
17、聚合酶的一部分）,当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时，校正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的3端去除 给了DNA聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会,1.DNA合成缓慢或 无DNA合成,错配的最后一个碱基对,外切核酸酶活性位点,2. 错配核苷酸的去除,3. 重新进行DNA合成,无需DNA脱离聚合酶即可 进行校正，引物-模板接头 从DNA聚合酶活性位点 滑动到外切核酸酶活性位点,当聚合酶把不正确核苷酸 掺入DNA后，DNA合成 速率降低，引物3端与 DNA聚合酶活性位点 的亲和力减弱,错配后引物的3端 与校正外切核酸酶 活性位点的亲和力 增加，与此位点结合后 错配核苷酸即被除去,当不正确的碱基对 被
18、去除后，正确配对的 引物-模板接头又滑回 到DNA聚合酶活性位点,校正外切核酸酶键盘上的“delete”（删除）键 只能将最近发生的错误去除掉 校正外切核酸酶极大地增加了DNA合成的精确度，从每添加105个核苷酸插入1个错误碱基降低到每添加107个核苷酸插入1个错误碱基 但是仍然高于细胞中观察到的实际突变概率：每添加1010个核苷酸出现1次错误） 下一章：复制后的错误修复,3. The replication fork（复制叉）,3.1 Both strands of DNA are synthesized together at the replication fork (复制叉上DNA双链
19、的两条链是同时进行复制的),在细胞中，DNA双链的两条链时同时进行复制的，这要求将双螺旋的两条链分开以形成两条DNA模板 replication fork： The junction between the newly separated template strands and the unreplicated duplex DNA （刚分开的模板链和未复制的双链DNA之间的连接区称为复制叉),Leading strand(前导链）,Lagging strand （后随链）,Okazaki fragment,Replication fork,已复制DNA,未复制DNA,前导链聚合酶运动方向,
20、后随链聚合酶运动方向,总的DNA复制方向,复制叉向着未复制的DNA双链区域运动，其身后留下指导两个 子代DNA双链形成的两条单链DNA模板,DNA的合成只能从53进行（沿着3端进行合成） 半不连续复制：两条暴露的模板中只有一条能够随着复制叉的运动进行连续复制，在此条模板链上，DNA聚合酶简单地尾随复制叉，此模板指导下新合成的DNA链称为前导链（ Leading strand） 另一条模板链指导DNA聚合酶在与复制叉移动相反的方向上运动，此模板指导下新合成的DNA链称为后随链（ Lagging strand），此条DNA链必须以不连续方式进行合成 在后随链上形成的新链DNA短片段称为冈崎片段（O
21、kazaki fragment）：细菌中1000-2000个核苷酸，真核生物中100-400个核苷酸 冈崎片段被合成出来之后，相互之间很快共价连接成一条连续的完整的新DNA链，因此冈崎片段是DNA复制中短暂的中间产物,半不连续复制模型的提出和证明：冈崎片段（Okazaki fragment）的发现,连续复制,半不连续复制,不连续复制,Okazaki选择T4噬菌体的DNA复制作为模型来研究 在逐渐缩短脉冲标记时间的情况下，用3H-脱氧胸苷来脉冲标记进行T4噬菌体DNA复制的大肠杆菌 2秒钟脉冲标记时间，通过超速离心测定新合成片段的大小,相对于离心管顶部的距离,放射性强度,DNA短片段,DNA长片
22、段,标记时间2秒,标记时间120秒,实验证据,相对于离心管顶部的距离,放射性强度,DNA连接酶基因 缺陷的T4噬菌体,标记时间60秒,突变的噬菌体,实验证据,3.2 The initiation of a new strand of DNA require an RNA primer（DNA新链的起始需要一条RNA引物）,所有DNA聚合酶均需要带有游离3-羟基的引物，不能从头启动 新DNA链的合成,DNA新链合成是如何开始的？ 细胞利用了RNA聚合酶有而DNA聚合酶没有的能力：从头开始合成新RNA链 Primase （引物酶）is a specialized RNA polymerase de
23、dicated to making short RNA primers on an ssDNA template. Do not require specific DNA sequence.（引物酶是一种能在单链DNA模板上制造短RNA引物的特殊的RNA聚合酶，这些引物随后由DNA聚合酶进行延伸） DNA Pol can extend both RNA and DNA primers annealed to DNA template （DNA聚合酶用与DNA模板退火的RNA引物或DNA引物都能够启动合成）,前导链和后随链都需要引物酶来起始DNA的合成。但是引物酶在这两条链上的工作频率却相差极大
24、-why? 每条前导链只需要一条RNA引物，相反后随链的不连续合成意味着每个冈崎片段都需要新引物 所以后随链的合成需要数百至数千的冈崎片段及其相关RNA引物 引物酶不需要特异DNA序列来起始新RNA引物的合成，相反引物酶只有在与其它DNA复制蛋白如DNA解旋酶结合时才被激活 引物酶一旦被激活，即用最新暴露的后随链模板合成RNA引物，而这种合成是没有序列特异性的,3.3 RNA primers must be removed to complete DNA replication（完成DNA复制必须去除RNA引物，并用DNA取而代之）,为了用DNA取代RNA引物， RNA酶H识别并除去各条RNA
25、引物的大部分 RNA酶H特异性地降解与DNA碱基配对的RNA（H：RNA-DNA杂交链中的杂交，hybridazation） 除了与DNA末端直接相连的RNA引物外， RNA酶H可除去其它所有的RNA引物 RNA酶H只能断裂2个核糖核苷酸之间的键,A joint efforts of RNase H, DNA polymerase & DNA ligase （ RNA酶H: 特异性降解与DNA碱基配对的RNA ； 5-核酸外切酶； DNA聚合酶； DNA连接酶-填充切口）,只有当所有的RNA引物都被替代而且相关的切口均被填充后， DNA的合成才结束,DNA连接酶（DNA ligase)：在毗邻
26、的5-磷酸基团和3-羟基之间形成一个磷酸二酯键，填充切口,The initiation of a new strand of DNA require an RNA primer（DNA新链的起始需要一条RNA引物）,所有DNA聚合酶均需要带有游离3-羟基的引物，不能从头启动 新DNA链的合成,起始DNA合成的RNA引物是如何被发现的？ 支持RNA引发DNA合成的实验证据？,抗生素利福平能够抑制大肠杆菌细胞提取物对M13噬菌体DNA的复制 利福平特异性地抑制大肠杆菌RNA聚合酶的活性，但是不抑制DNA聚合酶的活性,M13利用大肠杆菌RNA聚合酶合成用于DNA复制的RNA引物？,RNA 引物,关键
27、实验证据：,DNA酶不能完全降解冈崎片段，总会留下一些10-12bp的RNA小片段,Tuneko Okazaki的研究工作,原始研究论文的工作,用加帽酶，鸟苷酰转移酶以及-32PGTP 标记RNA引物的5端 如果引物在5端被降解，那么就会失去放射性标记,先对引物进行放射性标记，再用DNA酶处理冈崎片段， 去除其DNA部分，然后将剩余的产物进行凝胶电泳,DNA酶降解前,DNA酶降解后,M,a,b,c,d,e,f,g,h,M,泳道d，h: 大肠杆菌野生型菌株 泳道a，e: 缺陷型菌株,(RNA酶H缺陷）,泳道b, f: DNA聚合酶I的核酸酶活性缺陷菌株,泳道c, g: RNA酶H和DNA聚合酶I
28、核酸酶活性均缺陷菌株,结论：大肠杆菌冈崎片段的合成由10-12bp的RNA引物引发 野生型菌株中由于存在降解RNA的酶，所以很难检测到完整的RNA引物,Abstract Intact primer RNA for discontinuous DNA replication of Escherichia coli has been detected by specific labeling in vitro of its 5-terminal tri- (or di-) phosphate group with vaccinia guanylyltransferase and -32PGTP.
29、A mutant defective either in RNase H or in both RNase H and DNA polymerase I accumulated about 10 or 30 times more intact primer RNA, respectively, than wild-type cells. The primers started with purine in an A to G ratio of 5 and the most abundant 5-terminal dinucleotide sequence was (p)ppA-Pu. The
30、chain length of the intact primer RNA was approximately 10 to 12 nucleotide residues. The structural properties of the E. coli primer RNA resemble those of the eukaryotic primer RNA.,3.4 DNA helicases unwind the double helix in advance of the replication fork（DNA解旋酶在复制叉之前解开双螺旋）,DNA聚合酶解离双链DNA的能力很差 DN
31、A解旋酶（ DNA helicase）：催化双链DNA两条链的分离 这种酶使用ATP水解的能量结合到单链DNA上，并沿着其定向移动，以去除任何退火到其结合的单链DNA上的DNA链,DNA解旋酶分离双螺旋的两条链,DNA解旋酶,（环形的六聚体蛋白）,与后随链模板结合,为解旋酶的运动提供能量,DNA解旋酶的延伸性(Processivity)：每次和底物结合后可解开DNA上的多个碱基对，具有高度的延伸能力，解旋酶只有到达其环绕的DNA末端时才被解离下来 DNA解旋酶的极性（polarity): 解旋酶在单链DNA上都沿着一定的方向运动，5-3，3-5。此方向始终是根据其结合的DNA链而不是去除的那一
32、条链决定的 解旋酶沿单链DNA的运动也需要化学能量的提供ATP水解提供能量,3.5 Single-stranded binding proteins (SSBs) stabilize single-stranded DNA（单链结合蛋白使单链DNA稳定）,新产生的单链DNA必须保持碱基未配对状态，直至可被用作DNA合成的模板为止 为了使分开的链稳定，单链DNA结合蛋白（SSB）迅速地结合其上 一个SSB的结合会促进另一个SSB与其紧邻的单链DNA结合-协同结合（ Cooperative binding），SSB分子相互之间也能够结合，大大稳定了SSB与单链DNA之间的相互作用 协同结合使单链D
33、NA随着DNA解旋酶的释放而很快被SSB所覆盖，一旦覆盖，单链DNA即处于伸直状态，抑制分子间的碱基配对 SSB以序列非特异性方式与单链DNA相互作用：静电相互作用，无氢键作用,Cooperative binding（协同结合） 额外的SSB优先结合到先前已有SSB分子结合的DNA 附近。只有当最初结合的单链DNA被SSB完全覆盖 后，其它DNA分子才发生结合,SSB,额外SSB 的结合,3.6 Topoisomerase removes supercoils produced by DNA unwinding at the replication fork（拓扑异构酶除去DNA解螺旋时在复制
34、叉上产生的超螺旋）,3.7 Replication fork enzymes extend the range of DNA polymerase substrate （复制叉酶扩大了DNA聚合酶底物的范围）,DNA聚合酶本身只能使与单链DNA模板退火的引物有效的延长。而引物酶，DNA解旋酶以及拓扑异构酶（复制叉上工作的酶）等极大地扩大了DNA聚合酶可能的底物范围 引物酶提供了在任何单链DNA上都能起始新的DNA链的能力 DNA解旋酶对双链的解离和拓扑异构酶对正超螺旋的消除使DNA聚合酶能够复制双链DNA 虽然不同生物中这些蛋白质名称不同，但是细菌，酵母，人等生物均使用这一套酶的活性来完成DN
35、A的复制保守性,大肠杆菌： 引物酶：DnaG DNA解旋酶: DnaB,如何证明大肠杆菌的DnaB蛋白具有DNA解旋酶的功能？,原始研究论文的工作,The Escherichia coli dnaB replication protein is a DNA helicase. J.Biol.Chem. 1986，261: 4738-4748.,环状的M13噬菌体DNA,5-端32P标记的短线性DNA,游离的 5-端32P标记 的短线性DNA,引物酶：DnaG DNA解旋酶: DnaB SSB：单链结合蛋白,-,-,-,游离的 5-端32P标记 的短线性DNA,-,-,-,-,-,-,-,-,-
36、,Abstract Genetic and biochemical analyses indicate that the Escherichia coli dnaB replication protein functions in the propagation of replication forks in the bacterial chromosome. We have found that the dnaB protein is a DNA helicase that is capable of unwinding extensive stretches of double-stran
37、ded DNA. We constructed a partially duplex DNA substrate, containing two preformed forks of single-stranded DNA, which was used to characterize this helicase activity. The dnaB helicase depends on the presence of a hydrolyzable ribonucleoside triphosphate, is maximally stimulated by a combination of
38、 E. coli single-stranded DNA-binding protein and E. coli primase, is inhibited by antibody directed against dnaB protein, and is inhibited by prior coating of the single-stranded regions of the helicase substrate with the E. coli single-stranded DNA-binding protein. It was determined that the dnaB p
39、rotein moves 5 to 3 along single-stranded DNA, apparently in a processive fashion. To invade the duplex portion of the helicase substrate, the dnaB protein requires a 3-terminal extension of single-stranded DNA in the strand to which it is not bound. Under optimal conditions at 30 degrees C, greater
40、 than 1 kilobase pair of duplex DNA can be unwound within 30 s. Based on these findings and other available data, we propose that the dnaB protein is the primary replicative helicase of E. coli and that it actively and processively migrates along the lagging strand template, serving both to unwind t
41、he DNA duplex in advance of the leading strand and to potentiate synthesis by the bacterial primase of RNA primers for the nascent (Okazaki) fragments of the lagging strand.,DNA Pol can not accomplish replication without the help of other enzymes The born and death of a RNA primer: primase and RNase
42、 H/exonuclease/DNA Pol/ligase Dealing the DNA structure (helicase, topoisomerase, SSB),DNA解旋酶以及拓扑异构酶行使其功能时，并没有永久性地改变DNA的化学结构，只是使DNA分子的构象发生改变 DNA解旋酶仅仅将DNA双链维持在一起的氢键打开而没有断裂任何共价键 构象的变化对于双链DNA分子的复制是至关重要的 在复制叉上工作的蛋白质与DNA密切作用，但采用的是序列非特异性的方式 很多蛋白质具有环绕(DNA解旋酶）或者包裹DNA （DNA聚合酶）的功能，以保持与DNA的结合,4. The specializa
43、tion of DNA polymerases （DNA聚合酶的特化）,4.1 DNA Pols are specialized for different roles in the cell （细胞中DNA聚合酶为行使不同功能而被特化）,DNA聚合酶在高效而精确复制基因组过程中处于核心地位 细胞中具有多种被特化的DNA聚合酶 原核生物和真核生物,原核生物-大肠杆菌5种DNA聚合酶： DNA聚合酶III（DNA Plo III):染色体复制中最主要的酶，很强的延伸能力 DNA聚合酶III核心酶 DNA聚合酶III全酶更大的具有高度延伸能力的复合体 有校正外切核酸酶活性高度精确性 DNA聚合酶I
44、（DNA Plo I): 专门用于除去起始DNA合成所需的RNA引物，具有5核酸外切酶活性，可以去除RNA酶H所不能除去RNA-DNA连接(能将DNA合成位点最上游的RNA引物迅速除去） 延伸能力不强，每次结合仅能添加20-100个核苷酸。适用于RNA引物的去除和在所产生的单链DNA缺口中进行DNA的合成 有校正外切核酸酶活性-高度精确性 DNA聚合酶II, IV,V: 用于DNA修复，无校正活性,真核生物-15种DNA聚合酶： 对于真核生物基因组复制至关重要的有3种： DNA Pol DNA Pol DNA Pol /primase：参与新DNA链的起始，四亚基蛋白复合体由二亚基的DNA P
45、ol 和二亚基的引物酶组成。引物酶合成RNA引物后，所产生的RNA引物-模板接头立即与DNA Pol 结合以启动DNA合成 DNA Pol /primase的延伸能力较低，很快被高延伸性的DNA Pol 或者DNA Pol 取代 DNA Pol 或者DNA Pol 取代DNA Pol /primase的过程称为聚合酶的切换（ Polymerase switching，the process of replacing DNA Pol /primase with DNA Pol or DNA Pol ） 导致在真核细胞复制叉上有3种不同的DNA聚合酶在工作 其它DNA聚合酶大多参与DNA的修复,真
46、核细胞DNA复制过程中聚合酶的切换,DNA Pol：后随链模板 DNA Pol ： 前导链模板,引物酶进行 RNA引物的 合成,聚合酶进行 DNA的合成,4.2 Sliding clamps （滑动夹）dramatically increase DNA polymerase activity （滑动夹极大地增加了DNA聚合酶的延伸能力）,复制叉上高度的延伸能力确保了染色体的快速复制 DNA聚合酶可以在不脱离模板的情况下合成成千上万的碱基对 但是在没有其它蛋白质存在的情况下， DNA聚合酶在复制叉上仅能合成20-100个碱基对后即从模板上脱离下来 问题：什么原因使这些酶在复制叉上的延伸能力如此显
47、著的提高？,具有高延伸能力的关键原因：DNA聚合酶与被称为滑动DNA夹（ Sliding DNA clamps ）的蛋白质结合 这些蛋白质由多个相同亚基组成，并组装成”油炸圈饼“的形状,与DNA结合的滑动DNA夹的三维结构,DNA聚合酶与滑动DNA夹的相互作用,DNA聚合酶与滑动夹所形成的复合体在DNA合成时 沿着DNA模板高效移动,滑动夹,问题：与滑动夹的结合是如何改变DNA聚合酶的延伸能力的？ 无滑动夹：DNA聚合酶平均每合成20-100个碱基对就从模板上解离并散落开来 有滑动夹： DNA聚合酶的活性部位仍经常从DNA的3-OH末端脱落，但是其与滑动夹的结合阻止了聚合酶从DNA上散开 通过
48、保持DNA聚合酶与DNA的紧密接触，滑动夹使DNA聚合酶能够迅速地重新结合到同一引物-模板接头上，从而大大增加了DNA聚合酶的延伸能力,滑动夹增强了相结合的DNA 聚合酶的延伸能力,DNA聚合酶从引物-模板接头上释放下来,DNA聚合酶重新与同一引物-模板接头 结合并继续DNA的合成,无引物-模板时DNA聚合酶的释放,当单链DNA模板完全复制后，DNA聚合酶必须从此DNA和滑动夹上释放下来，从而在新的引物-模板接头处工作 DNA聚合酶的释放：通过依赖于环结合DNA的DNA聚合酶与滑动夹之间亲和力的变化来实现 与引物-模板接头结合的DNA聚合酶和滑动夹之间有很高的亲和力。但是当聚合酶到达单链DNA
49、模板的末端时，聚合酶构象发生改变，降低了其与滑动夹以及DNA之间的亲和力 导致DNA聚合酶的释放，使其可以在新的引物-模板接头上继续工作 但是滑动夹仍然与DNA保持结合,释放DNA聚合酶后，滑动夹并不立即从复制的DNA上脱落下来。相反其它必须在DNA新合成处作用的蛋白质通过与滑动夹蛋白的相互作用而执行功能 例如：真核细胞中组装染色质的酶与真核生物滑动夹（称为PCNA）之间的相互作用被募集到DNA的复制部位（Eukaryotic sliding DNA clamp is PCNA） 一些蛋白质通过与滑动夹之间的相互作用在它们最被需要的时候聚集到新的DNA合成部位,Sliding DNA clamps are found across all organism and share a similar structure,大肠杆菌滑动夹,T4噬菌体滑动夹,真核生物滑动夹 （PCNA蛋白的三聚体）,滑动夹蛋白是不同生物DNA复制体系中的保守部件，不同生物滑动夹结构是保守的,4.3 Sliding clamps are opened a