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1、微生物学实验,吉林大学生物基础实验教学中心,常用培养基的制备、灭菌与消毒,目的要求 培养基分类 消毒与灭菌 结果检查,实验目的：1.了解培养基的配制原理 2.掌握配制培养基的一般方法和步骤 培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代 谢产物的营养基质 原则：目的明确 ;营养协调;控制PH、渗透压等条 件;经济节约 方法：生态模拟；查阅文献; 精心设计; 试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查,称量,熔化,调pH值,分装与加塞,包扎(1),包扎(2),灭菌,无菌检查,培养基种类: 碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水 一、按成份的不同划分 天然培
2、养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态划分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途划分 基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培养基,一级种培养基: 一级种又称母种，其培养基一般用试管作为容器，所以又称试管斜面培养基，这类培养基又常用于菌种分离提纯，扩大，转管及菌种保存等。 二、三级种培养基: 二、三级种培养基通常采用天然营养物质，如秸秆、棉籽壳、蔗渣等农作物废物，加适量的无机盐类等制成固体培养基。,牛肉膏蛋白胨培养基,牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂1520g，水1000
3、mL，pH7.07.2(后调),高氏1号培养基,高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂1520g，水1000mL，pH7.47.6。,查氏合成培养基,查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的培养基,其配方如下： NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g,琼脂1520g, H2O 1000ml,pH自然,麦芽汁培养基,用来培养酵母菌,干麦
4、芽粉加4倍水,在50-60保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止,调整糖液浓度,煮沸后，过滤，调pH为6.0。,BCG-MSG培养基鉴定几种常见的丝状真菌,新鲜平皿培养基,搁置斜面,消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 物理的方法：加热、过滤、辐射 化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。,加热法： 干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160170C）
5、加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在180； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70时才开箱门。,湿热法 ： 原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 4、注意事项： 1）冷空气彻底排除；2）加水；
6、3）压力降为“0”时方可打开。,在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表2,常压蒸汽灭菌： 对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。 煮沸灭菌法： 适用注射器和解剖器皿，时间1015min， 超高温杀菌 135-150C和2-8s对牛乳和其它液态食品灭菌。 优点 ：保持食品价值和营养成分。,过滤除菌： 原理：介质在有压力时阻隔微生物。 适用范
7、围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。 设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。 优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。 注意事项：1、压力适当； 2、无菌条件下进行； 3、防止渗透现象。,辐射灭菌： 原理：紫外线波长在200300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。 缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。 应用：无菌室，医院。 注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。,化学药品灭菌： 原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。 杀菌剂如重金属离子； 抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。 注意：与药品的浓度高低，时间长
8、短，微生物种类以及微 生物所处的环境有关。 常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸 福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等,常用消毒剂种类,各种消毒剂的应用,消毒与灭菌效果的检查： 消毒与灭菌效果好坏，直接关系到菌种成品率的高低。因此，除了要严格把好消毒、灭菌关外，同时还要严格执行检验制度，两者缺一不可。 培养基灭菌效果检验： 、试管母种培养基经灭菌后，从高压灭菌锅中不同部位随机抽取支，放置282恒温箱中培养5-7天,如无霉菌、细菌、酵母等杂菌出现，则认为灭菌彻底。,、原种及栽培种培养基经灭菌后，从灭菌锅中上、中、下三层进行取样，每层对角线随机取样瓶（袋），放置28-30恒温培养箱中培养5-7天，检查是否有霉菌菌落生成。如检查是否有细菌没有杀死，必须使用细菌培养基进行检测。上述抽取的样品，分别在无菌下取出少量培养基接入细菌培养基，然后在37培养24小时，检查结果没有细菌菌落产生，说明灭菌彻底。如某一位置试样出现杂菌，可能是锅内有“死角”，也可能是灭菌锅结构不合理，或没有按操作要求堆积， 气撒料，或一次性撒料过厚，或菌种瓶、袋过于拥挤，蒸汽流通不均匀造成；如不分部位，大部分或几乎全部瓶、袋都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，如果是高压灭菌锅出现这种现象，则说明是冷窑没有排除干净所致。,