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1、微生物学实验,吉林大学生物基础实验教学中心,无菌技术及无菌操作,无菌技术 灭菌方法 细胞培养无菌操作基本技术,无菌技术,无菌技术是用于细胞培养过程的术语，其基本原理可用于所有的细胞类型。无菌技术有两个主要目的，一是防止实验室的培养物被其他来源的微生物（如皮肤、衣服或周围环境的微生物）污染。二是防止实验工作者（包括老师和学生）被微生物感染。,无菌试验,无菌实验室,无菌操作,细胞培养无菌操作,P2 级无菌操作台,无菌操作,无菌操作室,无菌操作室,灭菌方法,消毒：一般指消灭病原菌和有害微生物 的营养体。 灭菌：一般指杀灭一切微生物的芽孢孢子及休眠体。 灭菌的方法： 一、加热法 二、过滤除菌 三、辐射
2、灭菌 四、化学药品灭菌,一、加热法,1、干热灭菌 方法：热空气灭菌和 灼烧。 机理：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。,2、湿热灭菌 方法：高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、煮沸消毒法和超高温杀菌法。 机理：利用高温（高于100）导致菌体蛋白质变性达到目的。,干热灭菌箱,湿热灭菌分类,1 高压蒸汽灭菌法 2 常压蒸汽灭菌法（间歇灭菌） 可采用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行。 3 煮沸消毒法 4 超高温杀菌,二、过滤除菌,主要是选用孔径小（一般0.2微米或0.4微米）的微孔材料（如磁土、 石棉、超滤膜等）制作成专门的细菌滤器，通过抽气泵进行减压过滤。 最广泛的过滤器有蔡氏过滤器和微孔
3、滤膜过滤器。许多材料如血清、抗生素及糖溶液都是采用此中方法过滤。 无菌滤膜（孔径0.2微米）过滤可以有效除去细菌，但不能除去病毒，因此过滤后的溶液不一定是没有病毒的。,配液 过滤 除菌连动线,三 、辐射灭菌,实验室的辐射灭菌通常用紫外线灭菌。 紫外线波长在200300nm具有杀菌作用， 其中以265266nm杀菌力最强。 机理：紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，另外由于辐射使空气中的氧气电离成氧离子，氧离子再使氧气氧化生成臭氧或使水氧化生过氧化氢，过氧化氢和臭氧有杀菌作用。紫外灯照射距离以不超过1.2米为宜。,四、化学药品灭菌,化学药品灭菌是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行
4、消毒灭菌的方法。 机理：能破坏细菌代谢机能使细菌不能增殖。 杀菌剂：能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学试剂 。如重金属离子等。 抑菌剂：只是阻抑细菌代谢机能使细菌不能增殖的化学试剂。如磺胺类试剂等 实验室常用的杀菌剂有2%煤酚皂溶液（来苏尔），0.1%升汞，3%5%甲醛溶液，75%乙醇溶液等。,细胞培养无菌操作基本技术 (1)实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌,用70% 酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染.实验结束后,将实验物品带出工作台.如需要继续进行下一个实验,则用70% 酒精擦拭
5、无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作。,(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通.实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内.实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。 (3)小心取出无菌实验用品,避免造成污染.切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作实验.容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。,(4)工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验.对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级).操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐物品伤人等。 (5)定期检查下列项目:CO2钢瓶内的CO2压力;CO2培养箱内的CO2浓度,温度,及水盘是否有污染;无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜,预滤网（300小时/预滤网,3000小时/HEPA)。,