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1、第八章:,DNA复制,Meselson 和Stahl的实验,M. Meselson and F.W. Stahl. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44: 671-682.,M. Meselson 和 F. W. Stahl 很想想出一种办法来证明Watson 和Crick的半保留复制模型. 1957年, 他们成功获得了DNA半保留复制的实验证据. 他们是采取的密度梯度离心的方法. Their paper was published in 1958 and ever s
2、ince, the experiment has often been referred to as: “one of the most beautiful experiments in biology.“,How It Began:,CsCl 密度梯度离心分离DNA,A. The Meselson-Stall experiment,B. the interpretation,(CsCl gradient centrifuge),Semi-ConservationReplication,DNA 复制中的一些问题,酶 拓扑异构问题 方向问题: 半不连续复制 启动,DNA 合成的化学反应 DNA
3、多聚酶 DNA Polymerase 复制叉 The Replication Fork DNA 复制过程,CHAPTER 8 The replication of DNA,原材料 反应方向 化学反应 引导 DNA合成的力量,DNA 合成的化学反应,DNA 合成所需要的底物,DNA 合成机理的图解,The Chemistry of DNA Synthesis DNA Polymerase The Replication Fork The Replication Process,CHAPTER 8 The replication of DNA,DNA 多聚酶,DNA 多聚酶,DNA 多聚酶的机理,
4、DNA 多聚酶有很多种类 DNA多聚酶亚基起到的作用,功能 机理,细菌的DNA多聚酶,DNA Pol III 全酶的组成,滑动夹 Sliding clamps,围绕新合成的双链DNA和与引物相连的聚合酶 确保了 DNA 与相同底物的再次结合，因此，增强了Pol的连续合成能力. 真核生物的滑动DNA夹是 PCNA,Sliding DNA Clamp,滑动 DNA 夹在所有的生物中都有发现，并且具有相似的结构,滑动 DNA 夹增强了连续合成能力,真核生物的DNA多聚酶,多聚酶开关,代替 DNA Pola/引发酶的过程 需要 Pold 或 DNA Pole.,DNA Polymerase,The s
5、pecialization of DNA polymerases,The mechanism of DNA Polymerase,Mechanism Function,The specialization of DNA polymerases,kinds of DNA polymerases The role of the subunits of DNA polymerases,拇指,手指,手掌,催化加入和移除 dNTPs的催化位点. 与两个金属离子结合，并因此改变的催化位点的环境. 增强磷酸键的稳定性,DNA 聚合酶手掌结构域,结合到导入的dNTP, 将可以正确配对的dNTP 导入到催化位点
6、 扭曲了模板链，使得模板链上的将要进行配对的一个核苷酸暴露出来，与dNTP结合。,DNA 聚合酶手指结构域,不直接参与催化 与合成的DNA作用来维持引物和催化位点的正确位置, 并且维持了 DNA Pol 和它的底物之间的强烈相互作用.,DNA 聚合酶拇指结构域,DNA 聚合酶手掌结构域,DNA 聚合酶手指结构域,拇指,手指,手掌,DNA 聚合酶,The specialization of DNA polymerases,The mechanism of DNA Polymerase,Subunits of DNA polymerases The role of the subunits,Mec
7、hanism,The specialization of DNA polymerases,Subunits of DNA polymerases The role of the subunits,Function,DNA rapid processive synthesis DNA 快速合成 DNA accurate synthesis DNA 精确合成,DNA Pol 是延伸酶,延伸能力是酶作用在底物上的一种性质. DNA Pol的延伸能力是酶每次与引物结合时加上的核苷酸数量.,一个位点可以催化加上的四种 dNTPs中的任何一种. 识别不同的 dNTP 通过进入的 dNTP i形成 A-T
8、和 G-C 碱基配对; 不正确的碱基配对会大大降低催化效率 通过空间位阻区分rNTP 和 dNTP ，将 rNTPs 排出活性位点.,DNA 精确合成,通过空间位阻区分rNTP 和 dNTP ，将 rNTPs 排出活性位点.,核酸外切酶校对新合成的DNA,偶然的碱基配对错误导致了 dNTP不配对. (10-5 错误概率) 不匹配的dNMP 通过核酸外切酶被去除.,复制后错配修复过程,The Chemistry of DNA Synthesis DNA Polymerase The Replication Fork The Replication Process,复制叉,新合成的模板链和未复制的
9、DNA双链的交界处,3.启动,原因: 聚合酶校对活性 启动过程:,1. 解开双螺旋,DNA 解旋酶解开了双链 DNA的两条链 拓扑异构酶破坏了超螺旋结构,2. 半不连续,前导链: 后随链:冈崎片段:,DNA 解旋酶在复制前解开双螺旋,六聚体蛋白,拓扑异构酶在复制叉处打开DNA超螺旋结构,单链结合蛋白 (SSBs) 稳定单链 DNA,协同结合 与序列无关的结合方式 (静电相互作用),3. Priming,Reason: polymerase proofreading activity priming process:,1. Unwind the double helix,DNA helicase
10、s separate the two base-paired strands of dupiex DNA Topoisomerase removes supercoils,2. Semi-discontinuously,Leading strand : Lagging strand:Okazaki fragment:,DNA 链增长的方式, II. 将新合成的短链结合在一起。 通过连接酶缺陷的T4噬菌体感染大肠杆菌 Kazunori Sugimoto, Tsuneko Okazaki, and Reiji Okazaki, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1968 6
11、0: 1356-1362.,半不连续复制的证据是由冈崎发现的 (1968),Reiji Okazaki was born near Hiroshima, Japan, in 1930. He was a teenager there at the time of the explosion of the first of two nuclear bombs that the US dropped at the end of World War II. His scientific career was cut short by his untimely death from cancer in
12、 1975 at the age of 44, perhaps related to his exposure to the fallout of that blast.,Tsuneko Okazaki, until recently, was a professor at The University of Nagoya where she was the first woman at that institution to be named a professor. Currently she is on the faculty of Medicine in Fujita, and doe
13、s research on centromeres.,冈崎实验,这个实验清晰地证明了1000-2000-核苷酸片段的 “冈崎片段”. 这些碎片在DNA复制完成后加入正常的DNA。 根据冈崎的实验提出DNA复制遵循 “back and fill” 机理.,E.coli t-,2, 7, 15, 60,pulse-labeling in dT-H3,stop in KCN 0,D.S. DNA,S.S. DNA,Density gradient of sucrose,Measure H3-T,pulse-chase,20 in dT-H3 30,transfer to dT then contin
14、ue,H3-T,pulse-chase,pulse-labeling,120,60,15,7,2,DNA replication in Okazaki fragment 1kb,3. Priming,Reason: polymerase proofreading activity priming process:,1. Unwind the double helix,DNA helicases separate the two base-paired strands of dupiex DNA Topoisomerase removes supercoils,2. Semi-discontin
15、uously,Leading strand : Lagging strand:Okazaki fragment:,合成一条新的 DNA 链需要 RNA 引物,引发酶是一种专门的RNA聚合酶，致力于为单链DNA模板制作的短RNA引物。不需要特定的DNA序列。 DNA聚合酶可以按照DNA模板延长RNA和DNA引物,Priming of DNA synthesis,RNA 引物必须在 DNA 复制之后被移除,核糖核酸酶H，DNA聚合酶和DNA连接酶共同发挥作用,3. Priming,Reason: polymerase proofreading activity priming process:,1
16、. Unwind the double helix,DNA helicases separate the two base-paired strands of dupiex DNA Topoisomerase removes supercoils,2. Semi-discontinuously,Leading strand : Lagging strand:Okazaki fragment:,The Chemistry of DNA Synthesis DNA Polymerase The Replication Fork The Replication Process,CHAPTER 8 T
17、he replication of DNA,复制过程,起始 增长 终止,复制起始,DNA解旋和开始复制的位置.,复制起始的模型,复制器 起始子,DNA复制的起始,在大肠杆菌中 在真核细胞中,复制起始的复制子模型,3/18/05,由 Jacob 和 Brenner in 1963提出 所有的DNA 都来自一个独特的起点：复制子 复制起始的两种控制物：复制器和起始子,起始子: 特异性地识别复制器中的一个DNA元件并激活复制的起始,复制器: 足够指导DNA复制起始的整套顺式作用的DNA序列,复制器序列,3/18/05,OriC in E. coli chromosomal DNA,起始子蛋白的三种功
18、能:,结合到复制器, 弯曲/解开 一个 DNA序列, 与其他复制因子相互作用并引起它们起作用,DnaA in E. coli (all 3 functions), origin recognition complex (ORC) in eukaryotes (functions 1 & 3),Initiation of DNA replication in E. coli,Initiation in E. coli,Origins of replication,the sites at which DNA unwinding and initiation of replication occu
19、r.,The replicon model of replication initiation,replicator initiator,Initiation of DNA replication,in E. coli In Eukaryote,复制前复合物,pre-RC activation & assembly of the replication fork in eukaryotes,前复制复合体（pre-RCs） 由两种蛋白激酶激活 (Cdk and Ddk) 这两种蛋白只有在细胞进入S期时才被激活.,起始位点的激活:,Pre-RC 在每个细胞周期中只能被形成和调控来调节一轮的复制.,
20、Only one opportunity for pre-RCs to form, and only one opportunity for pre-RC activation.,复制起始的调节,Figure 8-31 Effect of Cdk activity on pre-RC formation and activation,Cell cycle regulation of Cdk activity and pre-RC formatin,The Replication Process,Initiation Elongation Termination,在复制中，同时合成前导链和后随链
21、。 为了协调两条链的复制, 多个DNA Pols 在复制叉发挥作用. DNA Pol III 全酶就是这样一个例子.,DNA Pol III全酶的构成,拓扑模型,The Replication Process,Initiation Elongation Termination,II型拓扑异构酶在分离子DNA 分子时被用到,端粒在DNA不连续复制中无法被完整保存下来,3,5,5,3,3,5,5,3,Leading strand synthesis,Lagging strand synthesis,3,5,5,3,5,3,5,3,DNA pol,DNA pol,Region of unreplic
22、ated DNA,Leading strand synthesis,Lagging strand synthesis,Telomeres cannot be maintained by semi-conservative DNA replication,3,5,5,3,5,3,5,3,Region of unreplicated DNA,Leading strand synthesis,Lagging strand synthesis,Telomeres cannot be maintained by semi-conservative DNA replication,端粒酶复制端粒,端粒酶延长了 3 末端,The Chemistry of DNA Synthesis DNA Polymerase The Replication Fork The Replication Process,