生物化学课件（杨洋）1-蛋白质结构与功能.ppt

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1、1,杨洋 Tel: 82801602 E-mail: ,生 物 化 学 Biochemistry,2,课 时 安 排,授课教师,选用教材：生物化学（第八版）查锡良 药立波 主编,内容,时间,1-3周 第一至三章 10-12周 第十一至十五章,4-5周 第六章 王卫平,6-9周 第七至十章 李 刚,13-17周 第十六至二十六章 张晓伟,授课人,3,绪 论 Preface,4,什么是生物化学？,生物化学是研究生命化学的科学，研究生物体内化学分子与化学反应的基础生命科学。它从分子水平探讨生命现象的本质，即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节及其在生命活动中的作用。,5,细 胞 的 基 本 构

2、 成,6,7,8,二、动态生物化学阶段,三梭酸循环机制,生物能原理,“中间代谢”网络,酶的化学本质蛋白质,体内主要物质的代谢途径,尿素合成途径,10,11,第二节 生物化学的主要内容,12,学习内容,生物大分子的结构与功能： 蛋白质化学、核酸化学、酶 物质代谢及其调节 糖、脂、氨基酸、核苷酸代谢， 生物氧化、代谢联系与调节 遗传信息的传递 DNA复制、RNA转录、蛋白质生物合成、 基因表达调控与基因工程 专题篇 肝胆生化、血液生化,13,学习生化基本方法与要求,基本概念要清楚 重点内容要掌握 章节之间会联系 课后复习很重要,14,参考书,Nelson DL, Cox MM：Lehninger

3、Principles of Biochemistry，Worth Publishers，New York，2000 Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L, Clarke ND：Biochemistry (5th ed). WH Freeman & Co. New York, 2002 Lodish H, Baltimore D, Berk A, Zipursky SL et al: Molecular Cell Biology (4th ed)., Scientific America Books, WH Freeman & Co., New York., 2000 K

4、arp G: Cell and Molecular Biology Concepts and experiments (3rd ed). John Wiley & Sons, New York. 2002,15,童坦君: 生物化学。北京: 北京大学医学出版社.2003。 贾弘禔:生物化学与分子生物学 (第2版)。北京:人民卫生出版社. 生命的化学（中国生物化学与分子生物学学会主办，上海） 国外医学 分子生物学分册（武汉） Annual Review of Biochemistry（生物化学年鉴, 美） Trends in Biochemical Sciences (简称TIBS，美),参考书,

5、16,第一篇 生物大分子的结构与功能,蛋白质：多种生理功能,酶：生物催化剂,核 酸：传递遗传信息,17,第一章 蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein,18,本章主要内容,蛋白质的分子组成 蛋白质的分子结构 蛋白质分子结构与功能的关系 蛋白质的理化性质,19,广泛存在于生物界 人体蛋白质含量占干重的45% 蛋白质具有多种生物学功能 基本组成成份、物质代谢、机体防御、 血液凝固、肌肉收缩、细胞信息传递 生命活动的物质基础,蛋白质(Protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。

6、,概 述,20,第一节 蛋白质的分子组成 蛋白质的元素组成 蛋白质分子的基本结构单位氨基酸 氨基酸的分类 氨基酸的性质,21,一. 蛋白质的元素组成,碳（50-55） 氢（6-8） 氧（19-24） 氮（13-19） 平均16% 硫（0-4） 其他：磷、铁、 锰、锌、碘等,22,蛋白质含量测定定氮法,蛋白质的平均含氮量为16 100克蛋白质16克氮 每克氮100/166.25克蛋白质 故：样品中蛋白质的含量 样品的含氮量 x 6.25,23,测得某一蛋白质样品的氮含量为0.40克， 此样品约含蛋白质多少克？,24,此样品中蛋白质的含量： 0.40X6.25=2.5克 0.4016%=0.40

7、0.16=2.5克,25,二. 基本组成单位：氨基酸,自然界中氨基酸有300多种，但组成人体 蛋白质的氨基酸只有20种（L-氨基酸）,（一）氨基酸的结构,-C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH2)-COOH -氨基酸 -C-C-C (NH2)- C - COOH -氨基酸 -C-C (NH2)- C - C - COOH -氨基酸,28,（二）氨基酸的分类（P9 表1-1）,非极性疏水性氨基酸：具有非极性R侧链，呈疏水 性，包括脂肪族和芳香族氨基酸。（9种） 不带电荷的极性氨基酸：具有极性R侧链，呈亲水 性，通常含羟基、巯基、酰胺基等。 （6种） 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸（含羧

8、基） （2种） 碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸 （3种）,29,（二）氨基酸的分类（P9 表1-1）,非极性疏水性氨基酸：具有非极性R侧链，呈疏水 性，包括脂肪族和芳香族氨基酸。（8种） 不带电荷的极性氨基酸：具有极性R侧链，呈亲水 性，通常含羟基、巯基、酰胺基等。 （7种） 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸（含羧基） （2种） 碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸 （3种）,非极性疏水性氨基酸,2. 极性中性氨基酸,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,32,（三）氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，即含有碱性的氨基又含有酸性的羧基 (既可解离成阳离子也可解离成阴离子)

9、。 解离方式取决于溶液的酸碱度,33,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸解离成阴,阳离 子的趋势及程度相同,既分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为该氨基酸的等电点，简称pI。 不同氨基酸等电点不同。,氨基酸在酸性溶液中能解离成正（阳）离子，在碱性溶液中能解离成阴（负）离子，这种性质叫两性电离或两性解离。,两性电离,等电点,34,2.紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,35,3.氨基酸的化学反应（茚

10、三酮反应）,氨基酸 茚三酮,蓝紫色化合物,570nm吸收,36,氨基酸定量分析（A570）,37,第二节 蛋白质的分子结构,高级结构或空间构象,二级结构 三级结构 四级结构,一级结构,38,一 基本概念,1.肽键：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱去一分子水形成的键。 2. 肽：氨基酸之间通过肽键连接而成的化合物称为 由两个氨基酸组成的肽称为二肽。由三个氨基酸组成的肽称为三肽。十肽以下的统称为寡肽。 3. 多肽：由多个氨基酸组成的肽则称为。（多寡无严格之分） 4. 氨基酸残基：组成多肽的氨基酸分子因脱水缩合而残缺不全称为。,39,5. 多肽链：由数十个到数百个氨基酸分别借肽键相互连接即成。

11、 6. 蛋白质：由一条或多条多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1,000,000道尔顿甚至更大,体内存在多种重要的生物活性肽：谷胱甘肽、神经肽,40,7. 氨基酸顺序：在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为。 8. 氨基末端：通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为或N-端； 9. 羧基末端：在另一端含有一个游离的-羧基，称为或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序，即N C方向 。 如下述五肽可表

12、示为：,Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 丝缬酪天谷,41,10. 肽键平面,参与形成肽键的4个原子（C，O，N，H） 位于同一平面， 构成肽键平面。肽键的CN键在一定程度上具有双键性质，不能自由旋转，它们所相连的四个原子基本处于同一平面。,42,二 蛋白质的一级结构,概念：是指氨基酸在蛋白质多肽链中的排列顺序。 一级结构是蛋白质空间结构的基础，对生物功能起决定作用。肽键是蛋白质一级结构的基本结构键。有些含有二硫键。 不同蛋白质中氨基酸的种类、数量和排列顺序各不相同，即不同蛋白质具有不同的一级结构。,43,牛胰岛素一级结构：A链（21aa)、B链（30aa),H2N-甘-异-缬-谷-谷胺

13、-半-半-苏-丝-异-半-丝-亮-酪-谷胺-亮-谷-天胺-酪-半-天胺-COOH,H2N-苯-缬-天胺-谷胺-丝-亮-半- 甘 - 丝 - 组 - 亮 - 缬 - 谷 -丙 -亮-酪-亮-缬-半-甘-谷 -精-甘-苯-苯-酪-苏-脯-赖-苏-COOH,S,S,A,B,44,三 蛋白质分子的空间构象,空间构象、空间结构、 立体结构、高级结构,维持蛋白质构象的化学键,蛋白质分子中原子和基团 在空间上的排列和分布,氢键 疏水键 离子键 二硫键 范德华力,45,多肽链本身折叠或盘曲所形成的局部空间构象,(一) 蛋白质分子的二级结构,-螺旋 (- helix),-折叠 (- pleated sheet)

14、,-转角(- turn),无规则卷曲 （random coil）,46,-螺旋 （-Helix ） (Pauling, Corey,1951),蛋白质二级结构的主要形式： -螺旋 & -折叠,存在于纤维状蛋白质（角蛋白：皮肤、毛发、指甲）和球状蛋白质。,47,（1）多肽链主链围绕中心轴螺旋式上升， 3.6个氨基酸/圈，螺距为0.54nm； （2）第一个肽平面羰基上的氧与第四个 肽平面亚氨基上的氢形成氢键， 方向与螺旋长轴平行； （3）一般为右手螺旋。 （4）肽链中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧, 其形状,大小及电荷影响-螺旋 的形成,-螺旋,特点,48,2. -片层（ -折叠， -pleated

15、sheets） (Pauling, 1951),-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而成。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。,存在于纤维状蛋白质（ -角蛋白：蚕丝、蜘蛛丝中丝心蛋白）和球蛋白中。,49,特点,1. 多肽链充分伸展，各肽键平面之间 折叠成锯齿状，侧链R基团位于锯齿状结构的上下方； 2. 两条以上肽链或一条肽链内的若干肽段平行排列，其结构靠氢键维系（羰基上的氧和亚氨基上的氢）； 3. 顺平行折叠：两条肽链走向相同；反平行折叠：走向相反。,反平行折叠,顺平行折叠,反平行折叠,顺平行折叠,3、-转角,一般由四个氨基酸组成，常见氨基酸：Pro（脯）,Gly（甘）

16、以主链间氢键维持稳定。,多肽链中180度回折处形成的特定构象。,51,4. 无规卷曲,无规卷曲：指没有确定性规律的肽链结构。,52,模体motif 2个或3个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形 成的具有特殊功能的空间结构。,钙结合蛋白,N,C,(二) 模体,锌指结构,53,(三) 蛋白质分子的三级结构,在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的特定格式的三维结构。指一条多肽链的整体构象。,N,C,主要化学键： 疏水键、离子键、 氢键、范德华力,54,三级结构的特点：,1、进一步盘曲、折叠的多肽链分子长度大 大缩短，呈棒状、纤维状或球状； 2、三级结构的

17、稳定性主要靠次级键维持， 尤其是疏水键； 3、疏水基团多位于分子内部，亲水基团多 位于分子表面； 4、分子表面或某些部位形成了发挥生物学 功能的特定区域。,56,(四) 蛋白质的四级结构,二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链，彼此借次级键相连，成为一定的空间结构，称为四级结构。 具有独立三级结构的多肽链 单位，称为亚基或亚单位， 单独亚基，多无生物学功能， 二个以上亚基聚合成为有完 整四级结构的蛋白质， 才有生物学功能。 维持亚基之间的化学键主要是疏水键,Hb,57,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,58,（五） 蛋白质分类,根据分子形状分类,球状蛋白质（易溶于水，多为功能蛋白） 纤

18、维状蛋白质（水溶性差，多为结构蛋白）,根据组成分类,单纯蛋白质（只含氨基酸） 结合蛋白质（除氨基酸外，还有辅基：糖、脂、磷酸、 金属离子等）,59,根据生物学分类（8类）,催 化： 酶 收 缩： 肌动蛋白、肌球蛋白 基因调节：组蛋白、阻遏蛋白 激素作用：胰岛素 保护作用：免疫球蛋白、血纤维蛋白 调节作用：钙调蛋白 结构作用：胶原蛋白、弹性蛋白 运 输：清蛋白、血红蛋白、载脂蛋白,60,根据溶解度分类,可溶性蛋白：可溶于水、稀中性盐和稀酸溶液的蛋白质 清蛋白、球蛋白、组蛋白 醇溶性蛋白：不溶于水、可溶于7080%的乙醇溶液 醇溶谷蛋白 不溶性蛋白：不溶于水、中性盐、稀酸、碱或一般有机 溶剂等 胶

19、原蛋白、弹性蛋白、角蛋白,61,第三节 蛋白质结构与功能的关系,各种蛋白质均有其特定功能 蛋白质功能由其空间结构决定 空间结构由一级结构决定,蛋白质的一级结构和空间结构均与蛋白质的功能有关,62,一. 蛋白质一级结构与功能的关系,（一）一级结构是空间构象的基础 RNase是由124aa残基组成的单肽链，分子中 8 个半胱氨酸Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质。,63,（二）一级结构与功能的关系,催产素收缩子宫平滑肌，具有催产功能；加压素主要收缩血管平滑肌，同时具有升压和抗利尿作用。有部分相同或类似的功能。例如，加压素也具有一定收缩子宫平滑肌的功能。,催产素（oxytoc

20、in）,加压素（vasopressin）,一级结构是生物功能的基础： 结构不同，功能不同；结构相似，功能相似,64,分子病：由于遗传物质（DNA）的突变，导致其编码的蛋白 质分子的氨基酸序列异常，而引起其功能改变的遗 传性疾病。,镰刀型红细胞贫血，1944年,正常：N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys- （谷） 病人：N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys- （缬）,Hb 链,(三) 蛋白质的一级结构与分子病,氧分压低时，血中红细胞呈镰刀状，极易溶血，并丧失了带氧能力。,结构改变，功能改变,65,66,二. 蛋白质的空间结构与功能的关系

21、,蛋白质空间结构是其生物学活性的基础，构象发生改变，其功能活性也随之改变。,例1：核糖核酸酶,尿素 -巯基乙醇,有活性,无活性,67,例2：血红蛋白与肌红蛋白,空间结构体现生物活性：结构相似，功能相似,68,血红蛋白 Hb: 2 2 ，血红素为辅基，携带O2 ， 亚基之间及内部有8对离子键，形成亲水的球状蛋白。,70,Hb的4个亚基与4个O2结合的平衡常数不同，通常第 一个亚基结合O2后，亚基的构象会发生改变，可促进其它亚基与O2的结合。,正协同作用,变构作用,变构剂,变构蛋白,凡蛋白质分子因与某种小分子物质相互作用发生构象改变，因而改变了这种蛋白质与其它分子进行反应的能力，这一现象称为变构作

22、用。,疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病（蛋白质构象改变）。,三 蛋白质构象改变引起疾病,72,第四节 蛋白质的理化性质,一. 两性游离和等电点,体内多数蛋白质pI为pH5.0，体液pH7.4,阴离子？阳离子?,等电点（pI）：在某一pH溶液中，某一蛋白质解离成阴、 阳离子的趋势相等，即所带正、负电荷正 好相等，此pH值称为该蛋白质的等电点。,pH pI,pH = pI,pH pI,73,二. 胶体性质,高分子化合物，在水

23、溶液中呈胶体溶液，具胶体溶 液的各种性质（分子扩散、布朗运动） 粘度较大 蛋白质胶体的颗粒较大，不能透过半透膜 (透析),三. 蛋白质的沉淀,分散在溶液中的蛋白质分子发生凝聚、 并从溶液中析出的现象。,74,维持蛋白质溶液稳定的要素：水化膜 表面电荷,蛋白质表面的亲水基团与水分子形成水化膜，使蛋白质 分子相互隔开，不易沉淀； 在一定的pH溶液中，蛋白质分子表面带有同种电荷，使 蛋白质分子相互排斥，防止聚集。,75,常用的蛋白质沉淀法：,1. 盐析法 高浓度的中性盐可以沉淀水溶液中的蛋白质。 硫酸铵、硫酸钠、亚硫酸钠、氯化钠 原理：破坏水化膜、中和电荷,不同种类的蛋白质盐析时所需盐浓度不同 蛋白

24、质的分离纯化,饱和硫酸铵： 清蛋白 半饱和硫酸铵：球蛋白、纤维蛋白原 饱和氯化钠： 纤维蛋白原,例：分离血浆蛋白质,76,2. 有机溶剂沉淀 乙醇、甲醇、丙酮 原理：破坏水化膜,3. 酸类物质沉淀 苦味酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸 原理：中和正电荷（pHpI） 应用：临床制备无蛋白血滤液,4. 重金属盐沉淀 铅、汞、银、铜 原理：中和负电荷（pH pI） 应用：给重金属中毒病人口服大量乳品或鸡蛋清,5. 加热凝固 加热使蛋白质变性，疏水基团暴露，发生沉淀,77,四. 蛋白质的变性,概念：在某些物理和化学因素作用下，蛋白质的空间构 象被破坏，从而导致其理化性质和生物活性的丧 失，但一级结构未发生改变

25、。,变性因素：加热、有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子等,应 用：消毒、灭菌 低温保存疫苗、酶等,变性与沉淀是两个不同的概念 变性不一定发生沉淀 沉淀也不一定发生变性,78,五.蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,79,六. 蛋白质的颜色反应：蛋白质的定性与定量,茚三酮反应 蛋白质溶液在pH57之间，与茚三酮溶液 作用呈蓝紫色。,蛋白质肽键,OH-,CuSO4,紫红色混合物,肽键类似于双缩脲结构,双缩脲反应,酚试剂反应 碱性条件下，蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸可 与酚

26、试剂反应生成蓝色化合物。,80,第 五 节 蛋白质分离、纯化与结构分析,一 蛋白质的分离纯化,1、透析及超滤法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 (ultrafiltration) 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,4、层析(chromatography)或色谱法,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个

27、固态物质（固定相）时，根据待分离蛋白质的颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而分离蛋白质。,凝胶过滤（分子筛，gel filtration；排阻色谱）：利用各蛋白质分子大小不同分离。 离子交换：蛋白质的电荷量及性质不同。 阳离子交换剂：CM-纤维素 阴离子交换剂：DEAE-纤维素 亲和层析：抗原-抗体，配体-受体，金属离子，生物素等 高效液相（HPLC）：反相HPLC，离子HPLC，凝胶过滤HPLC,5、超速离心,* 超速离心法(ultracentrifugation)：根据蛋白质的分子量与形状分离。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,90,本章主要内容,蛋白质的分子组成 元素组成（N：16%）； 氨基酸（结构、种类、性质） 蛋白质的分子结构 一级、二级、三级、四级（基本概念、主要形式） 蛋白质结构与功能的关系 一级结构、高级结构与功能的关系（举例） 蛋白质的理化性质 基本概念、应用,