细菌学教学课件 第五章 细菌的基因表达.ppt

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1、第五章 细菌的基因表达,一、细菌基因与基因工程概念 二、基因工程相关的酶学 三、基因工程的载体 四、细菌功能基因的结构 五、基因的转录 六、基因的翻译 七、原核基因表达系统,一、细菌基因与基因工程概念,1.1 基因是什么？ “能够表达出一个有功能的多肽链或功能RNA分子的核酸序列”。 1.2 基因工程（gene engineering) 将不同 的生物基因（供体）在体外人工剪切，组合并与载体（质粒，噬菌体，病毒）DNA连接，然后，引入原先没有这类基因的细胞（受体）内进行扩增，使转入基因在细胞内高效表达即合成该基因所编码的蛋白质或多肽。,二、基因工程相关的酶学,1、核酸限制性内切酶（restri

2、ction endonuclease) 2、连接酶（ligase) 3、聚合酶（polymerase) 4 、DNA和RNA修饰酶 5、核酸酶,2.1 核酸限制性内切酶 （restriction endonuclease),2.1.1 核酸限制性内切酶：一类能够识别和切割某种特定核苷酸序列且能产生具有二重对称特异序列（回文序列, palindromic sequence) 2.1.2 命名与表示： 细菌属名第一 细菌种名前两 菌株 个字母（大写斜） 个字母（小写斜） 例如：流感嗜血杆菌 Haemophilus influenza Rd(株） HindI, HindII, HindIII 方向5

3、 3 BamHI G GATCC EcoRI G AATTC SmaI CCC GGG,+,+,2.1.3 影响限制性核酸内切酶的活性 *DNA纯度 *DNA甲基化程度 *底物DNA的分子结构 *反应温度 *反应系统组成,2.1.4 限制性核酸内切酶应用 *DNA重组 *构建新质粒 *DNA物理图谱 *DNA分子杂交 *制备DNA放射性探针 *DNA序列分析,2.2 DNA连接酶(ligase),DNA连接酶：催化具有5-磷酰基与3-羟基末端彼此相邻的二条链形成磷酸二酯键的酶。 *大肠杆菌DNA连接酶 *T4 DNA连接酶 T4噬菌体DNA编码； Mg2+ 和ATP为辅助因子 粘端连接-低浓度

4、 平端连接-高浓度,2.3 聚合酶（polymerase),聚合酶：以DNA或RNA为模板，催化DNA及RNA的体外合成。 *大肠杆菌DNA聚合酶I 用于缺刻平移 （nick translation) *Klenow聚合酶 用于平末端补齐；cDNA的第二链；Sanger法测序分析, T4噬菌体DNA多聚酶 用于DNA片段末端标记 经修饰的T噬菌体DNA聚合酶 用于双脱氧终止法测序 * TaqDNA聚合酶 用于DNA序列分析 聚合酶链反应（PCR) *逆转录酶 （reverse transcriptase) 原核、真核生物mRNA 转录成cDNA,三、基因工程的载体,基因工程载体类型： * 质粒

5、载体 * 噬菌体载体 * 嵌合质粒载体 * 噬菌体质粒载体,3.1 质粒载体,3.1.1 质粒：指染色体之外的，能进行复制和遗 传的双链环状DNA分子。 表示符号：pBR322,pUC19, pSC101 严谨型，低拷贝，个质粒 松弛型，高拷贝，个质粒 3.1.2 质粒的复制 质粒半保留复制模式 严谨型质粒复制：依赖蛋白质合成与DNA聚合酶III 松弛型质粒复制：不依赖蛋白质合成，利用DNA聚合酶I 复制方向：单向或和双向,3.1.3 质粒的不相容性 不相容性：指某种质粒在寄主细胞存在时，将阻止其它类质粒进入细胞寄居。 同一不相容群的质粒不能在同一寄主中寄居。（如质粒pBR322与pUC19都

6、具有PMB1复制子） 非同一不相容群的质粒，可以在同一寄主中寄居。（如质粒pBR322与pSC101分别具有PMB1和PSC101复制子） 3.1.4 质粒的转移性 1、接合转移(conjugation) 2、转化 (transformation) *感受态转化(competent cell T.) *原生质体转化(protoplast T.) *电击转化 (electroporation T.),3.1.5 质粒中的选择标记 1、氨苄青霉素抗性（Ampr) 2、四环素抗性（Tetr) 3、氯霉素抗性（Cmr) 3.1.6 理想质粒载体的特征 、复制启始区 、合适的酶切位点 、筛选标记 、分子

7、量较小 5、核糖体结合位点,3.2 噬菌体载体,四、细菌功能基因的结构,4.1 启动子 4.2 编码区 4.3 终止子,4.1 启动子,启动子(promoter)：指与DNA依赖的RNA聚合酶相结合的一段DNA序列，约20300个碱基长度。 功能：是转录出目的基因mRNA。 结构：具有保守区，如Pribnow序列， -35序列（Sextama）和CAP-cAMP（分解代谢物激活蛋白）结合位点 强启动子和弱启动子 组成型和调控型,转录终止子： 类型： 1）在Rho因子的作用下使mRNA的转录终止。 2）根据DNA模板中的对称序列形成的“发卡”结构，使新生的mRNA终止转录。 质粒载体上的启动子上

8、、下游终止子的生物功用。,4.2终止子(Terminator),4.3 核糖体结合位点（Ribosomal Binding Site）,核糖体结合位点： 指紧靠启动子下游，从转录起始点延伸几十个碱基长度的一段序列，翻译起始密码ATG位于中心，与rRNA16S亚基3端互补的核心部分称为SD序列（Shine-Dalgarno Sequence） SD序列： 富含嘌呤，位于翻译起始密码ATG的上游约513个碱基。 典型序列 UAAGGAGG 和 AAGGA,4.3 信号肽的结构,大肠杆菌表达系统中常用的信号肽序列： （1）大肠杆菌phoA，ompA，ompT，ompF，lamB的信号肽 （2）欧文氏

9、菌的pelB信号肽 （3）粪肥单胞菌Cex信号肽 （4）金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽 （5）枯草芽孢内葡聚糖酶信号肽 （6）人生长激素信号肽,4.4 细胞外分泌,（1）利用大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达。如：溶血素基因 （2）与能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达，使目的蛋白渗透到细胞外。 如：大肠杆菌ompA的前导肽 细菌素释放因子 （3）培养基中加入甘氨酸，以提高外膜通透性。,4.5 芽孢杆菌中基因表达的特点,1、形成芽孢：可根据芽孢形成的不同时期表达不同的蛋白 2、多Sigma因子：RNA聚合酶的功能需要因子，而芽孢杆菌存在众多的因子，如A (43，55），B (37 ) ，D ，

10、E ，H ，gp38 和gp3334 芽孢杆菌中存在双启动子基因或操纵子，有的是重叠的，有的是非重叠的。,五、基因转录,转录周期 起始 延伸 终止,六、基因的翻译,原核生物,翻译总过程 （上） 多核糖体（下）,七、原核基因表达系统,1、大肠杆菌表达系统 2、芽孢杆菌表达系统 3、乳酸菌基因表达系统 4、链霉菌基因表达系统,7.1 大肠杆菌表达系统（Gene Expression system in E.coli）,7.1.1 大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正

11、常栖居菌。 其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。,7.1.2 大肠杆菌表达系统的特点： （1）遗传背景清楚 （2）目的基因表达水平高 （3）培养周期短（20分钟） （4）抗感染能力强,7.1.3 大肠杆菌表达系统研究的发展趋势,完善现有的表达系统； 重组蛋白质的正确折叠； 构象形成； 蛋白质的分泌； 菌体表面表达技术及其应用； 重组蛋白质修饰加工。,7.2 芽胞杆菌表达系统（Gene Expression system in Bacillus）,7.2.1 特点 枯草芽孢杆菌是非致

12、病的土壤微生物，严格生长在有氧条件下。 枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和质粒适合用作克隆载体。 芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如-淀粉酶，蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵技术发达。 具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。 易于分离纯化分泌蛋白,7.2.2 枯草杆菌宿主菌株 由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆菌无效 （1）选择可转化的菌株 *168菌株及突变体： 营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入 （2）选择转化的方法 感受态转化： 原生质体转化： 电转化：甘氨酸添加培养感受态 其它方法，如转导、结合转移,7.2.3 可作为宿主的

13、其它菌种： 嗜碱芽孢杆菌Bacillus abcalophilus 蛋白酶 淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefacilus -淀粉酶 短芽孢杆菌Bacillus brevis 蛋白酶 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 淀粉酶，抗真菌肽 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 淀粉酶 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 蛋白酶,球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus 灭蚊毒素蛋白 嗜热芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 高温-淀粉酶 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis

14、杀虫晶体蛋白 耐碱的芽孢杆菌Bacillus alcalophilic 碱性蛋白酶 炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis,7.3 乳酸菌基因表达系统（Gene Expression system in Lactic Acid Bacteria）,7.3.1 特点： 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。 大多数不运动，少数以周毛运动。 菌体常排列成链。 在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO等物质的称为异型乳酸发酵。 有微好氧菌和专性厌氧菌。,7.3.2 Lactic Acid Bacteria,Gene

15、ra: Streptococcus Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus Enterococcus Lactococcus,All the above genera grow in chains. Many are used for the food industry.,7.2.4 枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势,（1）表达真核基因 蛋白酶水解缺陷型、抑制剂 （2）表达商业用酶 克隆基因的整合 （3）表达杀虫晶体蛋白 提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱 （4）利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强在医 药领域多个方面的应用,7.3.3 研究进展,（1）食

16、品发酵方面的应用,（2）乳酸菌菌种鉴定 REA （Restriction Endonuclease Analysis） 16S rRNA （PCR ） SDS-PAGE,（3）抗微生物和食品腐败,（4）细胞表面层和外多糖 利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管电泳鉴定技术。,（5）蛋白质降解、多肽降解和脂降解,（6）分子遗传学 基因克隆 表达调控 染色体分析,（7）益生菌（PROBIOTICS） Lactobacillus and

17、 Bifidobacterium,食品级载体不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作为选择标记，因而更为安全，在食品、医药方面具有广泛的应用潜力。 乳酸菌的食品级 高效诱导分泌表 达NICE系统是可 控制的蛋白质生 产的最理想的系 统。,7.4 链霉菌基因表达系统（Gene Expression system in Streptomyces ）,7.4.1 特点 大多数来自于土壤 能形成孢子的革兰氏阳性菌 有复杂的形态（以无中隔分 枝菌丝方式生长）和生理生 命周期 产生多种次级代谢产物 基因组是大肠杆菌的两倍， GC含量高，平均为74%,7.4.2 链霉菌的载体 （1）高拷贝载体 pIJ1

18、01 40-800 拷贝 硫链丝菌素（tsr），新霉素（neo），酪氨酸酶（mel） （2）低拷贝载体 pIJ920 1-2拷贝 广泛宿主 能插入大于30kb的片段 （3）穿梭载体 pHJL210（SCP2*/pBR322） （4）柯斯载体（cosmid） 构建基因文库,（5）接合转移载体 pBR322/pIJ101/RK2（IncP）（转移功能） （6）噬菌体载体 C31衍生的，如KC304， KC505 （7）表达载体 利用PtipA启动子构建的表达载体 pIJ6021 （8）分泌载体 利用S.longisporus 分泌的枯草杆菌素抑制剂subtilisin（SSI）分泌和抑制丝氨酸蛋白

19、酶特性构建 如pIJ702,（9）其他载体 （A）大容量载体 细菌人工染色体BAC 利用F因子复制起始点/par元件，1-2拷贝，克隆100-300kb的片段 （B）整合型载体 利用pSAM2整合元件构建的pPM927 （C）高表达载体 整合高表达载体pCJR24，是利用天蓝色链霉菌A3中的激活调节基因actII-ORF4与actI基因启动子构建的,7.4.3 链霉菌基因转移的方法 （1）原生质体转化 转化率不高 ,制备过程中影响因素多,系统对外源DNA的限制修饰作用 （2）接合转移 DNA以单链形式进入宿主菌 大肠杆菌S17-1菌株, 质粒RSF1010 （3）电脉冲穿孔 转化率比原生质体高

20、10-100倍 （4）噬菌体转导,7.4.4影响链霉菌中基因表达的因素,（1）启动子对外源基因表达的影响 （2）信号肽对外源蛋白分泌的影响 A、信号肽N末端氨基酸序列正电荷数对基因表达的影响 B、信号肽切割位点后的氨基酸数对基因表达的影响 C、信号肽和目的蛋白之间的距离对基因表达的影响 （3）密码子、SD序列和终止子等对基因表达的影响 链霉菌中翻译起始密码子为ATG或GTG，终止密码子为TAA或TAG （4）DNA扩增序列对基因表达的影响 （5）发酵条件对外源基因表达的影响,7.4.5 链霉菌表达系统优缺点及研究发展趋势,（1）优点： 链霉菌工业化培养条件成熟,适合于大规模产业化 链霉菌基本为

21、非致病菌,不产生内毒素 可以进行高密度培养,在稳定期仍能维持异源蛋白的产生 链霉菌可分泌胞外酶,利用信号肽可分泌外源蛋白 链霉菌中有许多可利用转录起始信号,利用它可以高表达外源基因,（2）缺点： 由于研究链霉菌表达有生物活性的真核来源的蛋白还处于初级阶段,许多实验结果不具有普遍规律,存在的问题有下列方面 高活性启动子 信号肽切割位点的氨基酸序列 蛋白酶的水解 次级代谢可控制启动子 翻译后加工,（3）研究发展趋势 结合基因组学和转录组学,完善基因表达系统 优化组合强启动子,信号和先导肽, 从分子水平研究其结构元件与功能的关系 在蛋白水平研究蛋白的分泌机理,特别是蛋白的转位和转膜机制 研究次级代谢产物生物合成酶系的结构,构建新化合物文库,用于新药的开发,