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1、链霉菌诱变育种方案,11级生物技术班 第二组,元芳!此事你怎么看?,看目录,一、诱发突变 （一）、出发菌株选择 （二）、诱变剂及诱变剂量的选择 （三）、影响诱变效果的因素 （四）、平板分离 二、突变株的筛选 （一）、初筛 （二）、复筛 （三）、产物活性测定 三、营养缺陷型菌株的筛选 四、高产变株最佳环境条件的调整,插曲(很有必要),诱变育种的一般程序如下： 出发菌株-菌种纯化(出发菌株性能测定)-制备斜面孢子-制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)-诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)-平板分离(测定变异率)-挑取变异菌落并移植至斜面上-初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)-斜面传代-复筛(复
2、筛数据分析，精确测定生产性状)-变异菌株(菌株参数分析)-小型或中型投产试验-大型投产试验。,（一）、出发菌株的选择 选择从自然界(土壤）中分离链霉菌 放线菌是产生抗生素活性最大的一类微生物，迄今已在工业、医学、农业上都有利用抗生素成功的实例，而链霉菌又是放线菌中抗生素的主要产生菌，具有广泛的物种多样性和代谢多样性，是重要的资源微生物，但在链霉菌中普遍存在遗传不稳定性，而引起抗生素产量下降。,因此,我们要研究提高抗生素产量的方法，已期获得更大产量的抗生素，而提高产量的最重要途径是通过育种改变生产菌种。诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法，因而在抗生素的菌种筛选中应用最广泛。,一、诱发突变,
3、菌种的纯化：,1、土壤用无菌水浸泡，静置取上清 2、做梯度上清分别稀释10倍、100倍、1000倍等等 3、使用链霉菌优势培养基（在上边链霉菌比其他菌长的快），用步骤2的各个梯度液体分别铺板。 4、按照链霉菌最适生长温度培养。 5、选取菌落数在100个左右，菌落清晰无重叠的平板。 6、根据伯杰氏菌种鉴定手册中链霉菌的菌落外观介绍，粗选出基本符合的链霉菌。,7、挑取选出的菌落摇瓶培养，按照伯杰氏手册做理化指标检测。 8、符合伯杰氏手册上理化指标的，提总DNA，做16SrDNA扩增，测序 9、测序结果在NCBI上blast，最终确定菌种,链霉菌单孢子悬液的制备：,所处理的细胞必须是处于对数生长期同
4、步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液，将121灭菌的无菌水加入到培养有链霉菌斜面的试管中，用接种环轻轻刮下孢子，(所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液），将含有孢子的无菌水转入三角瓶中，加入玻璃珠，在摇床上打碎，经滤膜过滤后即得到单孢子率在98以上的单孢子悬液。,目的：在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA的结构变异频率大幅度提高。,选择该出发菌株的原因如下：,对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 可采用划线分离法和稀释分离法进行纯化； 该菌株变异幅度广； 该菌株稳定性较好。,（二）、诱变剂的选择及诱变剂量的选择,选择物理诱变
5、剂中非电离辐射即紫外线。 因为紫外线是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂，大约有80%的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。 紫外线的诱变育种 紫外线的作用机制是使两个嘧啶之间聚合，形成嘧啶二聚体，碱基不能正常配对。,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253.7nm，灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。,最适诱变剂量的选择,在诱变育种中有两条重要的实验曲线: 剂量-存活率曲线 剂量-诱变率曲线 通过比较以上两曲线，可找到剂量-存活率-诱变率三者的最佳结合点。在实际工作中，突变率往往随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再
6、提高剂量反而会使突变率降低。根据UV、X射线和乙烯亚胺,等诱变效应研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变较多地出现在偏高的剂量中。因此，在诱变工作中，大多倾向于采用较低剂量（致死率在70-80%）。,紫外线诱变的操作步骤：,1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，加入无菌生理盐水洗涤再离心。 2将菌悬液放入巳灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液通过滤纸过滤，单细胞滤液装入试管内，使细胞数约为108个ml，作为待处理菌悬液。 3取24ml制备的菌液加到直径7cm培养皿内，放入,一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照
7、射前，应先开紫外灯预热10min，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。,4取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。,（三）、影响诱变效果的因素,（1）菌种遗传特性 各菌株因遗传特性不同，对诱变剂敏感性也不一 样。 （2）菌体细胞壁结构 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗 入细胞。 （3）环境条件的影响 环境条件的影响包括： 诱变前预培养和诱变后培养
8、 温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响,由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，使链霉菌细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，能将链霉菌细胞一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。并测定出其变异率（变异数与观察总个体数的比值）。 挑出变异菌落并移植至斜面上。,（四）、平板分离：,分离后得到的菌落，真正能发生性能变好的所谓正突变个数极少，要从几千万个菌落中选出几个好的，与自然选育中的筛选方法相同。可分为初筛（平板筛选、摇瓶发酵筛选)和复筛。 筛选的方法：随机乱向筛选 定向筛选 突变是随机不定向的，
9、但是筛选是定向的，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的“筛子”。,二、突变株的筛选,初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围。 复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离，选育高产或其他优良菌株。 多级水平筛选：由于诱变产生高产突变株的频率很低，而且实、验误差又很难避免，所以筛选工作中常用多级筛选，一利于优良菌株的获得,筛选根据主次分为初筛和复筛,平板菌落预筛 根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提高筛选工作效率。 摇瓶发酵筛选 优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。,（一）、初筛,缺点：在
10、突变率小的情况下，如果菌落挑取少，很难筛选到理想的突变株,对初筛出来的菌株进行复筛时，通常采用摇瓶培养法，一般一个菌株至少要重复35个瓶，培养后的发酵液必须采用精确分析方法测定。 复筛过程中，要结合各种培养条件进行筛选，在不同培养条件下进行试验。,（二）、复筛,筛选步骤如下：,1、步骤：摇瓶培养通常分为初筛和复筛，初筛因菌株多常常一株菌一瓶，进行振荡培养，培养结束后逐个进行活性测定，将生产性能高的菌株用沙土管或冷冻管保藏。复筛时取出，以一株3-5瓶，振荡培养后，测定活性，以提高精确性。 2、优点：培养条件与发酵罐接近，这样筛选出来的菌容易在大生产中推广。,摇瓶培养:,3、注意事项：摇瓶的条件要
11、尽量与发酵罐接近。且各摇瓶间的培养条件要尽量一致（摇瓶型号，装量，瓶塞厚度或瓶口包扎纱布的层数，摇床转数，温度）,脂肪酶产生菌,透明圈法,成色圈法,果胶酶产生菌,生长圈法,抑菌圈法,一、根据平板菌落生化反应筛选变株,20,37,二、采用冷敏感菌筛选抗生素变株,三、浓度梯度法筛选法,四、复印技术快速筛选变株,测定不同酵母菌胞内脂肪含量的简单定量法,五、琼脂大通量筛选变株,1.琼脂平板活性圈法 2.纸片法:发酵液浓度高时 3.琼脂薄层纸片法 4.自动生化仪器分析法,（三）、产物活性测定：,(水解酶、有机酸）,(产酸菌),(工具菌+待检菌),(抗生菌),本组方案采用琼脂平板活性圈法中的抑菌圈来测定其
12、活性。,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体 野生型菌株wild type strain 原始菌株 营养缺陷型auxotroph 人工诱变或自然突变 原养型菌株prototroph 回复突变或重组变异,三、营养缺陷型菌株的筛选,与筛选营养缺陷型有关三类培养基 (1)基本培养基MM (2)完全培养基CM (3)补充培养基SM,突变株的表型 检出方法 营养缺陷型 补充培养基 （auxotroph） 抗性突变型 药物培养基 （resistant mutant） 条件致死型 培养条件改变 （conditional lethal mutant）,基因突变的类型,诱发突变 淘汰野生型菌株 检出缺陷性 鉴别缺
13、陷性,营养缺陷性菌株的分离和筛选,选择合适的诱变剂与诱变方法 诱变剂和诱变方法都要简便有效 主要的诱变剂亚硝基胍,紫外线,亚硝酸 诱变方法 物理方法 化学方法 注意突变率还与诱变剂量有关,（一）、营养缺陷性的诱变,1.抗生素法 青霉素法（细菌） 作用于细菌细胞壁的主要成分肽聚糖 制霉菌法（酵母菌） 作用于真菌细胞膜上的甾醇,（二）、淘汰野生型菌株,2.菌丝过滤法 适用于真菌和放线菌 作用于丝状菌的孢子 3.高温杀菌法 适用于芽孢菌类 作用于芽孢菌类的芽孢和营养体,（三）、检出营养缺陷型,1.夹层培养法（延迟补给法）,2.限量补充培养法,3.影印接种法,需要注意两点 第一 防止菌落扩散和蔓延，在
14、培养基中加入脱氧胆酸钠 第二 为了克服孢子扩散而带来不纯现象，在操作方法上改进。,4.逐个检出法,1 、鉴定方法 一种方法是加入一种物质测定多株缺陷型菌株 一种方法是测定一种缺陷型菌株对许多生长因子的需求情况称为生长谱法,（四）、营养缺陷型的鉴定,2、营养缺陷型鉴定步骤 1测定缺陷性菌株所需生长因子的类别 2具体测缺陷该类别物质中的哪种因子 3用单一因子进行复证试验,（一）、营养缺陷性的诱变,营养缺陷型生长谱法鉴定 1. 氨基酸混合液； 2. 核酸碱基混合液； 3. 维生素混合液；,营养缺陷型的鉴定,测定方法 缺陷性菌株和基本培养基混合制成板，把生长因子分组直接点加于同一琼脂平上，培养后，观察哪一组或哪两组区产生混合生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。,缺陷性所需生长因子的测定,可用于微生物育种, 解除代谢反馈调控机制 做为生产菌种杂交，重组育种时的遗传标记 基础理论中，它被应用于阐明微生物代谢途径,营养缺陷性突变株的应用,四、高产变株最佳环境条件的调整,以 下 为 链 霉 菌 的 诱 变 育种 流 程,出发菌株（放线菌） 纯化 斜面培养 安全培养基同步培养 离心洗涤 过滤 孢子悬浮液 诱变处理 平板分离,挑取单菌落传种斜面 摇瓶初筛 挑出高产斜面 留种保藏斜面 传种斜面 摇瓶复筛 挑出菌株作稳定性试验和菌种特性考察 扩大试验,