《QC--青霉素-87菌种的优化选育.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《QC--青霉素-87菌种的优化选育.ppt（40页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、青霉素-87菌种的优化选育,发表人：王 茹 华北制药股份有限公司 102车间菌种QC小组 2006年6月,河北省第二十七次QC小组 代表会议交流材料,概述,2005年，我车间在青霉素-87菌种的生产中取得了巨大成绩，胜利地完成了股份公司下达的攻关任务，成本最低降至39元/十亿，而且在多项技术指标中已经赶超国内同行业其它厂家。菌种是抗生素生产的基础，其优劣决定着生产水平的高低，而菌种的优良特性只有通过不断的优化选育才能稳定在一个高水平。本课题围绕着优化选育青霉素菌种展开。,一 小组概况,表1. 小组成员一览表,小组 成员,菌种优化选育工艺流程图,砂土孢子,双碟菌落,斜面孢子,摇瓶接种,摇瓶培养,
2、菌种验证,二 发表对象简介,理由一,理由二,我车间青霉素的发酵水平与同行业 其他厂家相比还有很大差距。 车间方针目标：优化选育新菌种 力争产率1:1.6,根据上述理由，本小组确定以青霉素-87菌种的优化选育为本次活动的课题。,三 选题理由,图1 .我车间与其他厂家发酵单位对比图,调查 结果,2005年我车间开始使用-87菌种，生产水平稳步提高，1-6月份平均发酵单位59971u/ml，但与国内其他厂家相比，还存在不小差距。,平均单位:59971,平均单位:62959,调查12005年上半年车间月平均发酵单位情况,四 现状调查,调查 结果,青霉素-87菌种的孢子形态杂，弱孢子比例偏多，而且菌落的
3、放射线纹发散，说明菌种高产基因并没有得到充分体现.因此要想完成车间的攻关目标，就必须对青霉素-87菌种进行优化选育。,图2. 孢子镜检形态,图3. 菌落形态,调查2孢子显微镜和菌落形态观察,2%,五 制定目标,目标值确定依据：,在保证产品质量和收率的前提下，青霉素生产菌种发酵水平必须较原菌种提高2%以上，方可鉴定升级为新菌种。,菌种控制程序 HY/QP 0901-2000 新菌种标准 华北制药股份 有限公司,通过小组成员共同努力,小组活动目标是可以实现的,目标可行性分析,菌种优化选育是一项周期长、难度大、成功率低的工作。尽管车间在菌种选育工作投入较多，自2002年以来一直没有选育出新菌种。,1
4、.菌种通过自发突变和诱发突变，其基因将产生可稳定遗 传的变异。再通过菌种筛选和菌种优化，选育到高单位突变菌株是可行的。 2.从车间生产实际来看，组织了多次技术攻关。生产菌种优化选育后，发酵单位同比都有2%以上的提高。 3.小组成员由车间主任、工艺员、种子组组长及技术员 、技师等组成，专业技术素质高，选种经验丰富，管理到位，责任心强。,挑战性,可行性,为了提高优化选育效率，我们小组成员对影响优化选育的因素进行了认真的分析和讨论，绘制出因果分析系统图。,优化选育效率低,选育效率低,优化效率低,出发菌株不纯,诱变对象不适,诱变方法选择不适,摇瓶筛选周期不适,培养基成分不适,操作误差大,样品检测精度不
5、高,筛选工艺不适,六 原因分析,针对系统图的7条末端因素，小组成员逐项进行了验证。,验证一：出发菌种不纯,我们对0405年度所用过的出发菌种进行了纯度试验，结果显示所用过的出发菌种的纯度均高于95%。,表2 菌种纯度试验表,验证人：王群 付应艳,结论：不是要因。,七 确定要因,验证二：诱变方法选择不适,我们对0405年度所做过的诱变育种结果统计分析，-87谱系菌种的选育随着三种诱变方法使用次数的增加，致死率也随着下降，说明三种诱变方法对-87谱系菌种具有了一定的饱和效应，造成诱变效果的降低。,表3 致死率统计表,验证人：张小双 王世雯,结论：是要因。,验证三：诱变对象不适,-87谱系菌种诱变处
6、理对象一直采用休眠孢子。小组成员以87-44-117菌种的萌发孢子、不同生长阶段的菌丝、单菌落作为诱变对象，得到的变异率都明显低于休眠孢子。,表4 -87菌种在不同状态下的诱变结果表,验证人：康自力 王世雯,结论：不是要因。,验证四：操作误差大,操作人员共进行了4批次、每批30瓶的相同菌株发酵对照实验。以连续瓶的发酵单位作为样本经统计计算并分别做平均值-极差控制图，未出现超出控制界限的点子，也未出现点子排列有非随机的迹象，可认为操作误差处于受控状态。,验证人：王群 康自力,结论：不是要因。,验证五：摇瓶筛选周期不适,-87菌种原有摇瓶筛选实验的周期是6天，我们对87-44-117菌种在5天、6
7、天、7天、8天的筛选结果进行了比对，发现摇瓶实验中7天的发酵单位同最终筛选结果的吻合率最高。,表5 吻合率统计表,验证人：王群 付娟,结论：是要因。,验证六：培养基成分不适,小组成员对-87菌种在现有培养基的代谢情况进行了考察。,由上图可知，试验菌种的碳源利用全程快于对照菌种。,由上图可知，试验菌种的氮源利用全程快于对照菌种。,可见，试验菌种的碳、氮源利用都全程快于对照菌种。所以培养基中碳、氮源的不足，是造成试验菌种发酵后期单位增长缓慢的直接原因。,验证人：张伟 付娟,结论：是要因。,验证七：样品检测精度不高,实验室现用美国O.I.Analytical公司ALPKEM牌FS-IV型流体分析仪来
8、测量效价，允许误差范围在1%之内。用标定好的青霉素溶液（25000u/ml）分成一百个相同样品进行检测，均值为24862u/ml，标准差为25.6 u/ml,过程能力指数为1.42，说明过程能力充分，具备表达试验正确结果的能力 。 验证人：饶阳宾 付娟,结论：不是要因。,经调查论证，最终确定优化选育效率低的主要原因是：,主要 原因,1、诱变方法选择不适,2、摇瓶筛选周期不适,3、培养基成分不适,针对影响优化选育效率的主要原因，制定了相应的对策。,表6 对策表,八 制定对策,实施一：确定适宜的优化育种方法,第一步：以现生产菌种87-44-117为出发菌种，先加入化学诱变因子5-FU，再 通过高能
9、电子照射，然后分离到含有一定青霉素浓度的固体培养基上培养，进行复合诱变处理。,图9 菌种复合处理示意图,九 对策实施,自然培养,新菌种分离,斜面孢子,砂土孢子,图10 菌种纯化过程,第二步：通过自然分离培养的方法，结合摇瓶筛选试验， 对复合诱变得到的高产菌株进行优化稳定。,实施一：,第一步 复合处理所得高产菌落形态,第二步 通过自然优化后的菌落形态,效果：优化后菌种的高产特性非常明显，菌落形态纹理细密，呈现螺旋状。,图11 菌落形态示意图,实施一：,图12 孢子形态镜检图,效果：优化后菌种的孢子形态大小整齐，弱孢子比例明显减少，显示高产特性更加稳定。,为了使优化选育后的生产菌种具有代谢快、生长
10、周期长、耐低通气量等优良性状，决定延长初筛摇瓶发酵周期（从原有的6-7天延长到7-8天）；将原有的摇瓶装量从50ml/瓶增加到60ml/瓶。,实施二：设计具有定向选育功能的摇瓶试验,表7 筛选结果统计,效果：新方案的定向选育效率高，吻合率达到50%以上。,实施三：优化选育培养基配方,为了寻找合适的培养基配方，我们设计了L9（34）正交试验，对发酵培养基配方中的碳、氮源进行了调整。,表8 因素水平表,表9 正交试验结果分析表,由上表正交试验结果可得 1、直观最佳组合A1B2C2D1为配方1 2、通过计算所得的最佳组合A2B3C2D1为配方2 3、各因素间的主次顺序由其极差R可知为CADB,效果：
11、依验证试验结果确定配方2为最优培养基成分。,图13 验证试验,1菌种的生产能力提高，完成小组目标。,表10 摇瓶试验结果,十 实施效果,1菌种的生产能力提高，完成小组目标。,表11 优化选育前后生产菌种的发酵单位对比,通过对生产菌种-87的优化选育，其摇瓶单位较实施前提高10.5%，发酵单位也较实施前提高4.6%，巩固期较实施前提高6.6%。,结论,1菌种的生产能力提高，完成小组目标。,表12 优化前后-87菌种数理统计检验表,(1)F检验：设H0：12=22 查表F/2（200，200）1.643 FF0.01 接受假设：方差齐性,(2)u检验：设H0：12= 22 查表u/2（500）2.
12、82,UU0.005 拒绝H0,菌种在优化前后有极显著差异。,结论,1菌种的生产能力提高，完成小组目标。,2005年7月-12月G-87菌种共放罐256批，滤液产量36808亿单位/罐批，提炼收率80.17%，结晶收率91.41% 1-6月单位成本：43.729元/十亿，成果期成本：43.340元/十亿。 经济效益=(活动前成本-活动后成本） 工业盐产量 =（43.729-43.340） 690538.31 =26.86万元 本课题系数为0.7，则经济效益为： 26.86 0.7=18.8万元 利润=18.8万元,2效益,此效益已获公司 财务部门认证,表13 巩固措施表,十一 巩固措施,通过开展QC小组活动，使我们深深体会到它是提高企业竞争力的一个有效途径。通过全员参加，激发了员工掌握科学技术的积极性，灵活运用数理统计工具解决生产中一个又一个问题，实现了高质量，低成本，同时提高了小组成员的质量意识、参与意识、改进意识。QC小组下一个课题是优化单菌落的挑选，提高生产水平，进一步降低成本，增加效益。,十二 体会与打算,谢谢大家,人类健康至上 质量永远第一,