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1、第 二章 核酸的化学,The Chemistry of Nucleic Acid,核酸的概念和重要性,核酸的组成成分,DNA的结构,DNA和基因组,RNA的结构和功能,核酸的性质,核酸的序列测定,核酸的生物学功能和实践意义,核酸的发现： 1868年，瑞士青年科学家 F.Miescher,从外科绷带上脓细胞的 细胞核中分离得到一种 含磷较高的酸性物质， 称之为核素（nuclein）,核素实质是一种核糖核蛋白,一、核酸的概念和重要性,1889年Altman制备了核酸（nucleic acid）,193040年，Kossel & Levene等确定核酸的的组分：,1944年1951年，Avery等逐
2、步证实了DNA是遗传信息的携带者。 1953年，Watson & Crick提出了DNA的双螺旋结构模型，使生物化学进入了分子水平时代。 1958年，Meselson和Stahl用同位素标记证明DNA的复制方式是半保留复制。,除少数病毒（RNA病毒）以RNA作为遗传物质外，多数有机体的遗传物质是DNA。,病毒或只含DNA、或只含RNA，从未发现两者兼有的病毒。,DNA 原核细胞 真核细胞 蛋白质,核酸的分布,二、核酸的组成成分,核酸 nucleic acid,核苷酸 nucleotide,核苷 nucleoside,磷酸 phosphate,嘌呤碱 嘧啶碱 purine base pyrimi
3、dine base,（碱基 base）,核糖 脱氧核糖 ribose deoxyribose,（戊糖 amyl sugar）,腺嘌呤 鸟嘌呤,胞嘧啶 胸腺嘧啶（尿嘧啶-RNA）,（一）核糖和脱氧核糖,-D-2-核糖,-D-2-脱氧核糖,O,核糖 + H +,糠醛,甲基间苯二酚,FeCl3,绿色产物,脱氧核糖 + H+,-羟基-酮戊醛,二苯胺,蓝色产物,RNA和DNA定性、定量测定,（二）嘌呤碱和嘧啶碱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（A）,鸟嘌呤 guanine,（G）,H,次黄嘌呤,嘧啶,1,2,3,4,5,6,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶
4、 uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶 thymine,（T）,H,H,烯醇式,稀有碱基 ： 又叫微量碱基或修饰碱基，是主要碱基的衍生物。 如次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、二氢尿嘧啶。,（三）核苷戊糖与碱基结合物nucleoside,N,H,腺嘌呤,腺嘌呤核苷,糖与碱基之间的C-N键，称为N糖苷键,尿苷,OH,假尿苷（）,基本核苷的命名、符号 核苷名称由相应的碱基名和戊糖名加苷而产生 全名为“某碱基核糖核苷”或“某碱基脱氧核糖核苷” 简化为“某苷”或“脱氧某苷”。如腺苷 、脱氧腺苷。 核苷符号依据相应碱基而来，对于脱氧核苷则在碱基代号前加“d”。 DNA 、RNA分别有四种核苷,A G C U
5、,dA dG dC dT,(),核酸中的稀有核苷（修饰核苷） 假尿苷 胸苷T,7甲基鸟苷,缩写代号的表示方法,（1）核苷的碱基上的H被其它基团取代的表示方法： 将碱基取代基、取代位置和取代基数目写在核苷单字 代号（A、 T、 G、C、U）的左边，用小写英文字母代表 取代基。,取代基用下列小写英文字母表示 :,如：m62A表示腺苷嘌呤环上的第6位有两个甲基取代基，即 N6，N6-二甲基腺苷，右上角的数字为取代基在核苷分子碱基环上的位置，右下角的数字为取代基的数目。,例：,（四）核苷酸(nucleotide) 核苷与磷酸结合物 核苷酸是形成核酸大分子的基本单元。可以将核苷酸看作核苷的磷酸酯。,AM
6、P,dAMP,核糖分子中除了C1 位OH成苷外，还有C2、C3和C5 位三个自由羟基，可以分别生成相应位的核苷酸。 脱氧核糖分子中除了C1 位OH成苷外，则只有C3和C5位两个自由羟基，能分别生成相应位核苷酸。,2，3，5一核糖核苷酸,(2-AMP),(3-AMP),(5-AMP),3，5一脱氧核糖核苷酸,Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP),Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP),脱氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：,生物体内游离存在核苷酸多是5-核苷酸，通常不写出酯化位置（5略去
7、）。如5 AMP写成AMP。,碱水解RNA 2-与5-核糖核苷酸的混合物,酶水解DNA或RNA 5-核苷酸，还得到3-核苷酸,现在常用表示法在核苷符号左侧加小写字母p表示5-磷酸酯，右侧加p表示3-磷酸酯。如pA表示5-腺苷酸，Cp表示3-胞苷酸。若为2-磷酸酯，则需表明。如Gp2表示2-鸟苷酸。,H,腺嘌呤,胸 苷,胸苷-5-磷酸,各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。,在体内能量代谢中的作用：,ATP能量“货币”,UTP参加糖的互相转化与合成,CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,ATP的重要生理功能： 参与能量代谢。 各种三磷酸核苷酸参与DN
8、A 、RNA的生物合成（作原料）； 参与其它合成。如UTP参加糖转化、合成，CTP参与嘌呤、蛋白质的合成； 作辅酶的结构成分。如NAD、 NADP。,第二信使cAMP,3,5-环腺苷酸,环状核苷酸磷酸同时与核苷上两个羟基形成酯键,cAMP是一些激素发挥生理作用的媒介物被称为这些激素的第二信使。,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,（五）核苷酸的连接方式,水解部位 (1)pApCpGpU (2) pApC pGpU,结构式线条表示法,三、DNA的结构,（一）DNA的一级结构,由数量极其庞大的4种脱氧核糖核苷酸，通过3,5-磷酸二酯键连接起来的直线形
9、或环形多聚体。由于DNA的脱氧核糖中C-2不含羟基， C-1又与碱基相连，唯一可以形成的键是3,5-磷酸二酯键。所以DNA没有支链。,（二）DNA的双螺旋结构,1953年，Watson 和Crick 提出。,Francis Crick (35y),James Watson (23y),丹麦 哥本哈根,剑桥大学 Cavendish Lab.,1. 双螺旋结构的主要依据,（1）X射线衍射依据,（2）碱基成对的证据chargaff规则 a. 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即AT b. 鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数相等 ，即GC c. 含氨基的碱基（腺嘌呤和胞嘧啶）总数等于含酮基的碱基（鸟嘌呤和胸腺嘧啶）总
10、数，即A+C=G+T d. 嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T,（3）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。,2. 双螺旋结构模型要点,（1）两条多核苷酸链反向平行。,（2）碱基位于内侧，磷酸与核糖在外侧，彼此通过3,5磷酸二酯键相连。A与T、G与C配对，分别形成2和3个氢键。,（3）双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。,（4）大多数天然DNA属双链结构，有些病毒的DNA是单链分子DNA,直径2.0nm,螺距3.4nm (含10个碱基对),大沟2.2nm,小沟1.2nm,0.34nm,DNA双螺旋结构的稳定性的三种力量,1、碱基堆积力（主要因素） 双螺旋中
11、垂直方向的作用力 2、氢键 双螺旋中水平方向的作用力 3、离子键 磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子或阳离子化合物之间所形成的盐键 。,3. DNA双螺旋的构象类型,B-DNA：相对湿度为92DNA钠盐所得到的XRD提出的双螺旋结构,A-DNA：相对湿度为75以下,Z-DNA : 1979年底，Wang ,Rich等对人工合成的DNA片段制成晶体，经X射线衍射得到一种左手双螺旋，磷酸根和核糖的骨架呈现连写的Z字形，呈锯齿状，如“之”字而得名。它只有一个小沟。,在某些天然DNA中已发现了ZDNA片段，并执行某种细胞功能，但不十分清楚，可能与基因表达、调控有关。 BDNA和ZDNA之间可以相互转化
12、。 并非所有DNA都呈双螺旋结构，如噬菌体DNA，单链。,C-DNA：4446%相对湿度，螺距3.09nm，每转螺旋9.33个碱基对，碱基对倾斜6。可能是特定条件下B-DNA和A-DNA的转化中间物。,D-DNA：60%相对湿度，DNA中A、T序列交替的区域。每个螺旋含8个bp，螺距2.43nm，碱基平面倾斜16。,三、DNA的三级结构 - 超螺旋结构,1 、双螺旋DNA分子在二级结构基础上进一步扭曲 折叠形成的特定构象。 2 、环形双链DNA分子可以进一步扭曲成超螺旋结 构，首尾可共价连接成环状，分为负超螺旋、正超 螺旋。,当将处于松弛状态的双螺旋向左捻动时（即沿右手螺旋相反方向捻动），等于
13、解旋（所谓的“卸劲”）。处于这样状态的DNA分子相对于它的松弛状态是一种没有达到原有旋转状态的状态，所以称之欠旋。反之称为过旋。由于DNA分子的两端被固定，过旋和欠旋都会给双螺旋DNA分子增加了额外的应力。,超螺旋,松弛态,当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋（supercoils）来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持B构象。过旋DNA会自动形成额外左手螺旋，这样的超螺旋称之正超螺旋（positive supercoils）；而欠旋形成额外右手螺旋，称之负超螺旋（negative supercoils）。,向左捻,向右捻,松弛型,正超螺旋,负超螺旋,细胞
14、中的环状DNA一般呈负超螺旋，即： 右旋螺旋不足导致部分碱基不形成配对，分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋螺旋的不足。 正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解去过度的螺旋。,超螺旋的作用： （）可以影响DNA双链的解螺旋。,（）比伸展的DNA分子更紧密，体积小。结构上使DNA有更紧密的形状，在组装中具重要作用。,负超螺旋可以通过DNA的局部解旋消除，解旋区域通常发生在富含A/T的地方，因为这些部位稳定性比富含G/C的区域差。 DNA是负超螺旋时，解旋过程更容易进行。,松弛环形DNA,解链环形DNA,正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负
15、超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,四、DNA与基因组,（一）DNA与基因,亲本链,子链,子链,双螺旋结构模型提供了DNA复制的机理，解释了遗传物质自我复制的机制。 模型是两条链，而且碱基互补。复制之前，氢键断裂，两条链彼此分开，每条链都作为一个模板复制出一条新的互补链，这样就得到了两对链，解决了一个基本的生物学问题遗传复制中样板的分子基础。,DNA,Transcription,RNA （mRNA、tRNA、rRNA）,Translation,Protein,中心法则,基因,结构基因,基因组,调节基因,基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的
16、功能单位。,（二）原核生物基因组的特点,1. DNA大部分为结构基因，每个基因出现频率低。,2. 功能相关基因串联在一起，并转录在同一mRNA中。,3. 有基因重叠现象。只存在病毒DNA中。,（三）真核生物基因组的特点,1. 重复序列,单拷贝序列,中度重复序列,高度重复序列,2. 有断裂基因,mRNA,1 872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,：由于基因中内含子的存在。,例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)没有内含子。,五、RNA的结构与功能,RNA分子是含短
17、的不完全的螺旋区的多核苷酸链。,RNA局部螺旋区中两条链是反向平行的。,RNA类型：mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA、snRNA、asRNA,（一）tRNA (transfer RNA),tRNA约占RNA总量的15%，主要作用转运氨基酸和识别密码子。,tRNA分子量为4S，1965年Holley 测定酵母Ala tRNA一级结构，提出三叶草二级结构模型。,主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TC环含有T和；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。,一条多核
18、苷酸链自身回折遇到能配对的碱基形成螺旋区（臂）；不能配对的地方形成突环区（环）。,四环四臂结构，呈三叶草形, 氨基酸臂 ：七对碱基，富含G，末端为-CCA-OH，能接受活化的氨基酸 二氢尿嘧啶环（D环）：812个核苷酸，因具两个二氢尿嘧啶而得名。与氨基酰-tRNA合成酶的结合有关。 反密码环 ：7个核苷酸，中部为反密码子，可识别mRNA的密码子 额外环（可变环） ：318个核苷酸，是tRNA分类的依据。可变环决定了tRNA分子大小 TC环 ：7个核苷酸。通过TC臂与其它相连。几乎所有tRNA都有此环。它与核糖体的结合有关。,二氢尿嘧啶环,TC环,氨基酸臂,额外环,反密码环,三级结构： 倒L型,
19、（二）rRNA（ribosomal RNA）,占细胞RNA总量的80%，与蛋白质（40%）共同组成核糖体。核糖体分为大小两个亚基,（三）mRNA与hnRNA,mRNA约占细胞RNA总量的35%，是最不稳定的RNA。它的核苷酸序列决定了Pr的aa序列,* mRNA结构特点,1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2. 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构,帽子结构可保护mRNA免受核酸酶从5端的降解作用，并在翻译起始中具有促进核糖体与mRNA的结合、加速
20、翻译起始速度的作用。 多聚A尾可增加mRNA的稳定性和维持其翻译活性。,帽子结构和多聚A尾的功能,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,原核生物mRNA结构特点,一般都为多顺反子结构。即一个单链mRNA分子可作为多种多肽和蛋白肽链合成的模板。 mRNA的转录和翻译是耦合的， 即mRNA分子一边进行转录，同时一边进行翻译。 mRNA分子包含有先导区、翻译区和非翻译区，即在两个顺反子之间有不参加翻译的插入序列。,真核生物mRNA结构特点,mRNA的3-末端有一段多聚腺苷酸（polyA), 5-末端有帽子结构。
21、mRNA一般为单顺反子，即一个mRNA分子只为一种多肽编码。 mRNA的转录和翻译是分开进行的，先在核内转录产生hnRNA,转运到胞质内后，再在核外加工为成熟的mRNA，然后起翻译作用。,（四）snRNA和asRNA,snRNA主要存于细胞核中，占细胞RNA总量的0.11%，分子内含U多，称为U-RNA。与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。,asRNA可通过互补序列与特定的mRNA结合，抑制mRNA的翻译，还可抑制DNA的复制和转录。,（五）RNA的其它功能,1981年，Cech发现RNA的催
22、化活性，提出核酶（ribozyme）。,大部分核酶参加RNA的加工和成熟，也有催化C-N键的合成。23SrRNA具肽酰转移酶活性。,RNA在DNA复制、转录、翻译中均有一定的调控作用，与某些物质的运输与定位有关。,参与蛋白质合成的RNA有tRNA、mRNA、rRNA,六、核酸的性质,（一）一般理化性质,1.为两性电解质，通常表现为酸性。,2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，微溶于水、不溶于有机溶剂。常用乙醇溶液中沉淀核酸。,3.因为DNA多为线性不对称分子，所以DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。,4.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对稳定。常用此性质测定RNA组成或除
23、去溶液中RNA杂质。,Reason：因为RNA的核糖上有2-OH，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定随即水解，产生核苷2, 3-环磷酸酯（中间产物）。该环磷酸酯继续水解产生2-核苷酸和3-核苷酸。DNA的脱氧核糖无2-OH，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。,用于水解RNA的碱有NaOH、KOH，水解后可用HClO4中和，由于KClO4溶解度较小，溶液中大部分K即被除去。碱浓度一般为0.31mol/L，37下水解1824h就可完毕。如较高温度，则时间可以缩短。DNA一般对碱稳定，如在1mol/L NaOH中加热至100 4h生成小分子的寡聚脱氧核苷酸。,核酸的碱基具有共扼双键，
24、因而有紫外吸收性质，吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）。,5. 利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。,（二）核酸的紫外吸收性质,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的。,摩尔磷吸光系数(p),A-吸光值 c-每升溶液中p的摩尔数 L-比色杯内径,一般天然DNA (p)为6600，RNA为71007800。核酸(p)值较所含核苷酸单体的(p)要低4045。单链多核苷酸的(p)值比双螺旋结构多核苷酸(p)值要高。,当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（
25、减色效应）。,1,2,1.天然DNA,2.变性DNA,DNA紫外吸收光谱,3,3.核苷酸总吸收值,（三）核酸结构的稳定性,1.碱基对间的氢键（横向） 2.碱基堆积力（纵向） 3.环境中的正离子。,（四）核酸的的变性,双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状，只涉及次级键的变化，不涉及共价键的降裂。磷酸二酯键的断裂称核酸降解。,热变性：温度升高 酸碱变性：酸碱度改变 变性剂：尿素测定DNA序列；甲醛测定RNA,热变性和Tm,加热DNA的稀盐溶液，达到一定温度（80100度）后，双螺旋结构发生解体，两条链分开，形成无规线团，260nm的吸光度骤然增加，表明两条链开始分开，吸光度增加约40
26、后，变化趋于平坦，说明两条链已完全分开。,DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度(melting temperature, Tm)。,Tm,Tm,细菌DNA,病毒DNA,影响Tm的因素：,（1）G-C的相对含量：越高，Tm越高 （G+C）% =（Tm 69.3） 2.44 对于小于20bp的寡核苷酸： Tm4（G+C）+2（A+T）,（2）离子强度：介质离子强度低，Tm低。,（3）溶液的pH值：高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。pH11.3，DNA完全变性。pH5.0（酸性），DNA易脱嘌呤。,（4）变性剂：甲酰胺、尿素、甲醛等破
27、坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。,（五）核酸的复性（退火）,变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。需缓慢冷却，骤然冷却不能复性。,影响复性速度的因素：,（1）单链片段浓度,（2）单链片段的大小,（3）片段内重复序列的多少,（4）溶液离子强度的大小,（5）溶液温度的高低 （T 25）,DNA分子的变性,（六）分子杂交：退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链或DNA和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程,（ 分 子 杂 交 ）,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,5-CTGCATTGACGACT-3,3-GACGUAACUGCUGA-5,5-AGUC
28、GUCAAUGCAG-3,已知DNA链碱基序列，写出互补RNA链上碱基序列,探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。,原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。,点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。,Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,七、核酸的序列测定,Sanger的酶法和Gilbert的化学法,提要,本章主要介绍核酸的化学本质、结构和功能。总的要求是： 了解核酸的化学本质及DNA和RNA在组分、结构和功能上的
29、差异 弄清嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸和核酸在分子结构上的关系 了解核酸的结构和它们的性质、功能的相互关系。,注意： 核苷酸是核酸的基本组成单位，应以腺苷酸和胞苷酸为代表，彻底弄清核苷酸的化学结构和化学性质。结合有机化学把嘌呤和嘧啶的基本结构搞清楚，同时把核酸中存在的A、T、U、C、G的结构记熟。 注意嘌呤、嘧啶同核糖在哪个部位连接成核苷，核苷如何同磷酸连接成核苷酸，核苷酸又如何连接成一级结构的核苷酸链。要特别注意核酸的二、三级结构中碱基的配对规律。 从分析比较核酸分子的组成和结构上的特点，进而联系它们的性质和生物功能。,模板,引物,GGC,GGCC,GGCCATC,C,ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,ddATP,A,GGCCATCG,GGCCATCGTTG,G,ddGTP,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,T,ddTTP,