水产微生物学实验.ppt

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1、水产微生物学实验,实验一 微生物基本操作技术（2学时）,一、教学目标与基本要求 掌握微生物实验中常用的基本操作 二、实验内容,实验报告,思考题 1、玻璃器皿清洗和包装有哪些注意事项？ 2、细菌接种时有哪些注意事项？,实验二 细菌形态观察(2学时),一 实验目的 1、掌握无菌操作技术 2、掌握细菌涂片的制作技术； 3、掌握显微镜特别是油镜的原理和使用方法； 4、掌握生物科学绘图的方法。,二 实验器材 1、器材：香柏油、油镜洗液、显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、小滴管、培养皿、酒精灯。 2、培养基和试剂：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面菌种。,三 操作步骤,1、细菌涂片的制作 (1)取菌 用无

2、菌操作取菌。 (2)涂片 将带菌的液滴涂均匀。 应先在载玻片中央滴一滴生理盐水或蒸馏水，然后用接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂抹成适当大小的薄层。（无菌操作）,(3)干燥 涂片最好在室温中自然干燥，必要时，可将标本面向上，在火焰高处烘干，切勿靠近火焰，以免标本干焦、菌体变形。 (4)火焰固定 将已干燥的标本片涂面向上，使背面在酒精灯火焰上以钟摆速度通过三次，使固定后的标本片触及皮肤时的稍感烧烫为度，但决不能在火焰上烧烤，否则，菌体形态毁坏。,2显微镜观察 (1)低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。用4X或10X物镜观察找到合适的观察目标

3、。 (2)高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，换用40X观察。,(3)油镜观察 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。,3、生物科学绘图 绘图时用铅笔以线条构成物体大约轮廓，或以“点”来表现物体，

4、组成画面；或者在用线条构成物体的轮廓后，再用“点”的疏密来表现组织物体的层次结构紧密等。,实验报告,1、绘制油镜下观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌形态。 2、思考题 涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？ 使用油镜时，为什么必须用香柏油？,一、实验教学目标基本与要求 1、明确培养基的配制原理。 2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、实验内容 1、介绍培养基的配制原理和方法步骤 2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基等。,实验三 培养基的制备,三、实验材料,三 实验器材 1、溶液或试剂： 牛肉膏，蛋白质，NaCl，琼脂，1mol/L NaoH，1mol/L HCl； 2、仪器或其他用

5、具： 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养其也装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，PH试纸（PH 5.5-9.0），棉塞，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。,四、实验内容,牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：,固体培养基：添加1.5-2%琼脂 半固体培养基：添加0.5%琼脂,四、实验内容,四、培养基的配制： 同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。 注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作图示：,称量-配置-调节pH值-过滤-分装-灭菌 1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。,2.配调 向烧

6、杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。 如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。,3.调节pH值 培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。 4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。,5.分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。 分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面： （1）斜面：装量为管长的1/4-1/5

7、。 （2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。 （3）三角瓶：装量不超过容积1/2。,6.灭菌 塞棉塞，包扎，灭菌。 高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度。,四、实验报告 记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 五、问题和思考 l配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?,实验四 微生物接种技术 一、教学目标与基本要求

8、： 掌握各种微生物接种的基本操作技术。 二、实验内容 1斜面接种 2液体接种 3穿刺接种 4平板接种,三、实验步骤 将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。 常用的几种方法如下： 斜面接种 液体接种 穿刺接种 平板接种,1.斜面接种： 从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。 左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。,斜面接种示意图,2.液体接

9、种： 由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。 操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。,3.穿刺接种： 用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。 4.平板接种： 将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：,1)斜面接平板 a.划线法：见平板划线分离法。

10、 b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。 2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。,四、问题和思考 1.稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50左右，才倒入装有菌液的培养皿内？ 2.接种时，为何要尽量使试管平放？,实验五 细菌常用染色方法（2学时）,一 实验目的 1、巩固已学细菌涂片技术； 2、掌握细菌简单染色技术； 3、掌握革兰氏染色技术，并学习报告革兰氏染色的结果。,二 实验器材 1、器材：香柏油、油镜洗液、显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、小滴管、培养皿、酒精灯。

11、 2、培养基和试剂：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面菌种；待测菌1-2种；美蓝染色液；革兰氏染色液（结晶紫染液、鲁戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液）。,三 操作步骤 1、细菌涂片的制作 操作步骤同实验二。 2、简单染色法 只应用一种染料进行染色的方法。如美蓝染色法。 美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片上，滴加适量的（足够覆盖涂抹物即可）美蓝染色液，经1-2分钟，水洗、沥去多余的水分，吸干或自然干燥镜检。,3、革兰氏染色法 (1)在已干燥、固定好的涂抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，将菌膜覆盖为宜，经1-2分钟，水洗。 (2)甩去残水，滴加碘液染1-3分钟，水洗。 (3)脱色：滴加95%酒精2-3滴，

12、频频摇晃3-5秒钟，使酒精能均匀布满涂面，斜持玻片使酒精流出，再滴加酒精，直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色为止，之后水洗。脱色的时间，可根据涂抹片的厚度灵活掌握，通常在15-40秒之间。 (4)滴加番红复染液复染1-2分钟，水洗。 (5)用吸水纸吸干或自然干燥、镜检。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (6)按上述方法，在同载玻片上，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片染色镜检进行比较。（阳性紫色，阴性红色）,四 作业 1、分析几种细菌的革兰氏染色结果，阳性或者阴性？ 2、分析革兰氏染色过程中的注意事项有哪些？ 决定革兰氏染

13、色成败的关键是脱色时间。如脱色时间过长，革兰氏阳性菌也可被脱色而误认为革兰氏阴性菌。反之，革兰氏阴性菌也可以误认为阳性菌，脱色时间长短又受涂片之厚薄、脱色时玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，无法严格规定，一般可用已知的革兰色阳性菌和阴性菌作对照，可验证结果的准备性。 在染色过程中不可使染色液干涸。 选用适龄培养物，以培养18-24小进为宜，菌龄过长，由于细菌死亡或自溶也常使革兰氏阳性菌呈阴性反应。 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。,实验六 理化因素对微生物的影响（2学时）,一、实验目的 1了解紫外线对微生物生长的影响。 2了解化学药剂对微生物的作用。 3学习抑菌圈的测定方法。

14、二、实验器材 1器材：30W紫外灯、尖头镊子、无菌培养皿、玻璃刮铲、酒精灯、无菌圆形滤纸片、灭菌黑纸、1mL的无菌吸管、5rnL无菌水试管、恒温培养箱。 2培养基：牛肉膏蛋白胨营养琼脂。 3菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等液体菌种。 4药剂：0.1%HgCl2、0.5%AgNO3、0.5%CuSO4、5%石炭酸。,三、实验步骤 （一）紫外线对微生物生长的影响 1将营养琼脂制成平板； 2用无菌吸管吸取0.1mL培养18h左右的金黄色葡萄球菌菌液分别放入4个营养琼脂平板上，用无菌玻璃刮铲涂布均匀； 3在无菌操作下，用镊子取小块无菌牛皮纸放在平皿涂菌的表面遮住部分平板，把培养皿放在紫外灯下10-20

15、cm处的台面，打开皿盖，4个平板置紫外灯下分别照射1min、5min、10min和20min； 4然后关上紫外灯光，并用消毒镊子取出牛皮纸，再盖好皿盖，置于37遮光培养24h即观察结果。 5贴黑纸处有细菌生长，紫外线照射处无菌生长。,（二）化学药剂的抑菌、杀菌作用 1制平板 取融化的营养琼脂按无菌操作方法，分别倾入4套无菌培养皿中，制成平板。 2制菌悬液： 取5mL无菌水试管，按无菌操作方法倒入金黄色葡萄球菌菌种斜面，制成菌悬液，同法将大肠杆菌制成菌悬液。 3接种： 取无菌吸管1支，吸取少量葡萄球菌菌悬液，向第一个培养皿平板上滴1-2滴，再用无菌刮铲将菌液在平板表面涂布均匀，然后在皿盖上注明菌别。同样，将大肠杆菌菌悬液注入不同的平板上，并均各用无菌玻璃刮铲涂抹均匀。 4放药片： 用无菌尖头镊子将分别沾有0.1%HgCl2、0.5%AgNO3、0.5%CuSO4和5%石炭酸的圆形小滤纸片1块(最好事先浸于药品液后再烘干)放在每个平板表面，每皿贴上标签。 5培养与结果观察 将各皿放入28-32恒温培养48-72h后检查结果，如某药剂有抑制作用，则滤纸处四周出现无菌生长的抑菌圈，圈的大小可表示该药剂抑菌作用的强弱。,四、实验结果与思考题 （一）紫外线对微生物生长的影响 记录试验结果并绘图表示平板生长情况。 （二）化学药剂的抑菌、杀菌作用 将实验结果记录入下表：,