生物工程概论课件.ppt

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1、生物工程概论,动物科技学院,第一章 绪论,第一节 生物工程的概述,1.1 生物工程的产生及定义 1.2 生物工程的种类,1 .1生物工程的产生及定义,生物工程概念的提出 1917年匈牙利工程师提出： 用甜菜作为饲料进行大规模养猪,及利用生物将原料转化成为产品.,19世纪：人类有意识的利用酵母进行大规模发酵生产：酒精、面包酵母、柠檬酸,1928年 发现青霉素，同时以获取细菌的次级代谢产物抗生素为主要特征的抗生素工业成为当时生物技术的支柱产业。,20世纪50年代,氨基酸发酵工业成为生物工程的一个新成员 20世纪60年代 酶制剂工业的出现,20世纪末、21世纪初,人类基因组测序酵母基因组测序、水稻基

2、因组测序先后基本或全部完成，使生物技术发生了巨大的革命，逐步形成了以基因工程为核心的现代生物技术,生物工程定义的充实,1917：利用生物将原材料转化为产品 1982：应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物作为反应器，将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术,生物工程的定义：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的，即现代生物工程技术。,1.2 生物工程的种类,基因工程 细胞工程 发酵工程 酶工程 蛋白质工程 应用：农业、环境、食品、医药等多个方面,基因工程,也叫基因操作、遗传工

3、程或重组DNA技术，是20世纪70年代以后兴起的一门新技术。 基因工程(gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改变生物遗传特性的 技术。即按照人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因(DNA 分子)在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复 制、转录和表达的操作，也称DNA重组技术。因此，由该技术构建的且具有 新遗传性状的生物称为基因工程生物或转基因生物。,细胞工程,细胞工程(cell engineering)是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改 变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目

4、的，加速繁育动植物个体，或获 得某种有用物质的技术。细胞工程主要包括动植物细胞的体外培养技术、细胞 融合技术(也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。,发酵工程,发酵工程(fermentation engineering)是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段(主要是发酵罐或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化、大型化)生产各种特定的有用物质；或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。由于发酵多与微生物密切联系在一起，所以又有微生物工程或微生物发酵工程之称。,酶工程,利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能以及对酶进行的修饰改造，并借助于生物

5、反应器生产人类所需产品的一项技术。 主要包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计技术等。,蛋白质工程,蛋白质工程(protein engineering)这一名称是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的，它是指在基因工程的基础上，结合蛋白质晶体学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰、改造、拼接，以产生能满足人类需要的新型蛋白质的技术。,现代生物技术的发展 现代生物技术时期是以分子生物学的理论为先导，以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。 1944年美国微生物学家Avery等用实验证明了DNA是

6、遗传信息的携带者。 1953年美国学者Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构，1958年Crick又阐明了DNA的半保留复制模式，从而奠定了现代分子生物学的基础。 1961年Nirenberg，1965年 Holley，1967年Khorana分别对20种常见氨基酸以及起始和终止密码完成了破译。 1972年 Berg创建了DNA体外重组技术，这标志着生物技术的核心技术基因工程技术的开始。,生物工程发展的趋势,目前三个平台：DNA重组、细胞培养和DNA芯片 未来将会形成的几个新的平台 1.基因组平台 2.生物芯片 3.干细胞生物学 4.生物信息学 5.神经科学,第二章 基因工程,基因工

7、程基础,内 容,基因工程研究,基因工程的应用,第一节 基因工程基础,基因工程的定义、研究内容,基因工程的工具酶,基因工程的载体,基因工程中的一些主要分子生物学方法,基因工程gene engineering,运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。,基因工程的基本过程就是利用重组DNA（recombinant DNA）技术，在体外通过人工“剪切（cut）”和“拼接（splice）”等方法，对生物的基因进行改造

8、和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因。,基因工程是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。,基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,基因工程研究的理论依据,不同的基因有相同的物质基础,基因是可切割的,基因是可转移的,多肽与基因之间存在对应关系,遗传密码是通用的,基因工程技术路线,1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）,2、DNA片段和载体的连接重组体DNA,3、外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因文库,

9、4、选择基因（目的基因）,5、目的基因表达,切 接 转 选 表达,1.1基因工程的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA聚合酶,DNA连接酶,基因的剪刀,基因的针线,一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。 restriction endonuclease 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。,限制性核酸内切酶,根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 型酶、型酶、 型酶 型酶不适合做基因工程的工具酶 型酶在基因工程中也不常用 型酶是基因工程理想的工具酶,限制性核酸内切酶,型限制性核酸内切酶的基本特性,1、识别序列和切割位点,2、切割方式,3、同尾

10、酶和同裂酶,4、限制性片段长度：经限制性核酸内切酶切割后产生的DNA片段。 切割频率：某限制酶在该DNA切割位点出现频率,型限制性核酸内切酶的基本特性,1、识别序列,可识别长度为4-7bp的双链DNA特定序列，该识别序列（识别位点）常呈旋转对称性。,1、切割位点,切割位点与其识别序列一致，在其识别序列内切割DNA。,型限制性核酸内切酶的基本特性,2、切割方式,DNA的限制性酶切,型限制性核酸内切酶的基本特性,指来源不同、识别序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。,同裂酶指来源不同、而识别序列和切割方式均相同的核酸内切酶。,3、同尾酶和同裂酶,DNA连接酶,能够将两端DNA拼接起来的酶类 原

11、核生物主要有两种类型的DNA连接酶：Ecoli DNA连接酶和T4 DNA 连接酶。 最常见的是T4噬菌体DNA连接酶,DNA连接酶能够催化DNA链上彼此相邻的3-羟基（ OH ）和5-磷酸基团（-P），形成磷酸二酯键。,DNA连接酶,DNA连接酶就可以用来在体外连接DNA片段 DNA连接酶的作用 是将双螺旋DNA分子的某一条链上两个相邻核苷酸之失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口封闭起来，即催化3-OH和5-p之间形成磷酸二酯键，从而将具黏性末端的双链DNA、平末端双链DNA以及带缺口的双链DNA连接起来。,原核生物主要有两种类型的DNA连接酶,Ecoli DNA连接酶 T4DNA 连接酶 催

12、化反应能量来源 不同 T4DNA连接酶用ATP，而EcoliDNA连接酶则用NAD 催化平末端连接的能力不同 只有T4DNA连接酶能够连接两条平末端的双螺旋的DNA片段,(一)常用的DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶 T4噬菌体DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶,催化DNA体外合成反应,DNA聚合酶,DNA聚合酶I(DNasel)是一种单链多肽蛋白质，具有三种不同的酶催活性，即53的聚合酶活性、53的核酸外切酶活性和35的核酸外切酶活性。,主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针(图22)

13、,Klenow酶的主要用途,修补经限制性内切酶消化或其他方法所形成的5或3突出末端，制备平末端。 对具有3隐蔽末端的DNA片段作放射性末端标记。 cDNA克隆中的第二链cDNA的合成。 DNA序列测定。,T4DNA聚合酶,这是由T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物纯化而来，具有两种酶催活性，即53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。,主要用途,可将任何形式的双链DNA制备成平末端的双链DNA。 外切酶的活性比Klenow酶强200倍，并且在高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止 进行双链DNA的3末端标记。,T7DNA聚合酶,具有53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性 主要用途： 用于拷贝大分子量

14、模板的引物延伸反应； 如同DNA聚合酶一样，可通过单纯的延伸或取代合成的途径，标记DNA的3末端，也可用来将双链DNA的5或3突出端转变成平末端的结构。,修饰的T7DNA聚合酶,对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去35的核酸外切酶活性 修饰的T7DNA聚合酶的加工能力以及在单链模板上的聚合作用的速率增加了39倍 测序时常用此酶，故亦称测序酶,TaqDNA聚合酶,最适的活性温度是72，连续保温30min仍具有相当的活性 在补加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系中，能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，按5 3的方向合成新生的互补链DNA。,(二)分子克隆中常用的其他工具酶,甲基

15、化酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 逆转录酶 S1核酸酶 Bal31植酸酶,1.2基因工程的载体,载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,Vector，本质是DNA 携带外源基因进入到受体细胞的运载工具,基因克隆载体具备条件,在克隆载体合适的位置含有允许外源DNA片段组入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的多。,克隆载体能携带外源DNA片段进入受体细胞，或停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制。,具有能够直接观察的表型特征,基因克隆载体具备条件,克隆载体必须是

16、安全的。,易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。,根据导入的受体生物。可以分为： 大肠杆菌载体 植物载体 酵母载体 动物载体,基因克隆载体分类,大肠杆菌载体,质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体,将外源DNA导入原核生物细胞,1、质粒载体,质粒（plasmid）是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质，一般为双链的共价闭合环状DNA。,pBR322质粒载体： “P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。,质粒载体的条件,一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几方面的条件。 1具有

17、复制起点 2具有抗菌素抗性基因 3具有若干限制酶单一识别位点 4具有较小的分子量和较高的拷贝数,pBR322质粒载体的优点： 1、具有较小的分子量； 它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点， 3、具有较高的拷贝数,经过氯霉素扩增后,每个细胞中可积累1

18、000-3000拷贝。,质粒载体,pUC系列的载体是通过pBR322和M13两种质粒改造而来，它的复制子来自pMBl，Amp抗性基因则是来自R质粒的转座子。 与pBR322质粒载体相比，pUC系列的优点有如下三方面。 具有更小的分子量和更高的拷贝数。 适用于组织化学方法检测重组体。 具有多克隆位点MCS区段 MCS可以使两种不同黏性末端的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上。,a互补,载体的来自Ecoli的Lac操纵子的DNA区段，编码半乳糖苷酶氨基端的一个片段。异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型半乳糖苷酶实现基因内互

19、补(a互补)。当培养基中含有IPTG时，细胞可同时合成这二个功能上互补的片段，使含有此种质粒上述受体菌在含有生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(Xgal)的培养基上形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒上的多克隆位点时，可使半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破坏互补作用。这样，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。,噬菌体是一类细菌病毒的总称。,2、噬菌体载体,噬菌体颗粒的外壳是蛋白质，内部是核酸。,2、噬菌体载体,噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期。 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 具有溶原周期的噬菌体称为温和噬菌体。,2、噬菌体载体,噬菌体载体 M13噬菌体载体 噬菌粒载体,2、噬

20、菌体载体,3、柯斯质粒载体,也称黏粒载体，是指一类由人工构建的含有DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,噬菌体基因组是一长度为48 502bp的线性双链DNA分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链，称为粘端(cohesive end，cos)。这是将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。 噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以以环状形式存在，并且能够自然成环。,噬菌体载体的类型,1插入型载体 插入型的载体又分免疫功能失活和大肠杆菌半乳糖苷酶失活两种亚型。 前者凡有外源DNA插入的重组体都能形成清晰的噬菌斑 后者形成无色(浅蓝色)的噬菌斑 2置换型载体 在载体非必要区的两侧含有核

21、酸限制性内切酶两个切点，两个切点间的片段被取代后不影响噬菌体生活力的载体。可插入长度约为20kb的外源DNA。在可取代的区段中带有lacZ基因的相应序列时，重组体亦可用半乳糖苷酶失活法进行筛选。,柯斯质粒载体,柯斯(cosmid)质粒是一类由人工构建的质粒噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒、cos位点序列来自噬菌体，其克隆能力为3145kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。,柯斯质粒的特点大体上可归纳成如下4个方面。,1具有噬菌体的特性 高效地转导 ，噬菌体DNA同样的方式环化起来 ，不能够通过溶原周期，无法形成子代噬菌体颗粒。 2具有质粒载体的特性 具有质粒复制子 ，具有抗菌素抗

22、性基因 ,也有插入失活克隆位点。 3具有高容量的克隆能力 柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右,核酸分子探针的标记,1.3基因工程中主要分子生物学方法,核酸分子的杂交,多聚酶链式反应,核酸分子探针的标记,探针是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测定的分子。 核酸分子探针是指能与互补核酸系列复性杂交的特定已知核苷酸片断。,核酸分子探针的标记,切刻平移法 随机引物法 末端标记法,随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物。 随机引物法是近年发展起来的一种较理想的核酸探针的标记方法。,随机引物的探针标记,探针的末端标记,是基因工程及分子生物学

23、领域中最常用的基本技术之一 是基于在适宜的温度及离子强度等条件下，具有一定同源性的两条核苷酸单链可按碱基互补原则复性杂交形成双链的原理建立的 杂交的两条单链分别是核酸探针和待测核酸,核酸分子的杂交,核酸分子杂交的分类,核酸原位杂交 菌落原位杂交 斑点狭缝杂交 膜上吸印杂交,目前最常用的一种核酸分子杂交方法,膜上吸印杂交,原理：将待测核酸序列片段通过吸印技术转移结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相标记的核酸探针进行杂交并对其实行检测的方法。,固相支持物：硝酸纤维素滤膜 尼龙膜,分类： 涉及DNA吸印的southern吸印杂交法 涉及RNA吸印的northern吸印杂交法,吸印方法：虹吸转移

24、法 电泳转移法 真空转移法,膜上吸印杂交,概念,southern吸印杂交法,通过虹吸转移法、电泳转移法、真空转移法等转移方法将经电泳分离及变性的DNA片段转移到一定固相支持物上然后进行杂交并对其实行检测的方法,northern吸印杂交法,通过虹吸转移法、电泳转移法、真空转移法等转移方法将经电泳分离及变性的RNA片段转移到一定固相支持物上然后进行杂交并对其实行检测的方法,Southern 杂交,PCR技术是指在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶催化合成反应，体外扩增特异DNA片段的技术。,多聚酶链式反应,PCR每个循环需要三步： 变性 退火 延伸,反应条件,多聚酶

25、链式反应,94变性30s 55 复性30s 70-72 延伸30-60s 一共进行30轮左右的循环,引物 (primer) 是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。,PCR扩增方式,第二节 基因工程研究,目的基因的分离与制备,目的基因与载体的重组,将重组体导入受体细胞,重组转化体的筛选和鉴定,克隆基因的表达,目的基因（Objective gene）是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。,2.1目的基因的分离与制备,外源基因（Foreign ge

26、ne）：插入到载体内的非自身的DNA片段,基因化学合成法,2.1目的基因的分离与制备,基因生物制备法,DNA自动合成仪,cDNA文库法,PCR法,基因组文库法,基因分离的物理化学方法 鸟枪法(shot gun) cDNA文库的建立与基因的分离 直接从特定的mRNA分离基因 基因组文库的建立和基因的分离 从蛋白质人手分离编码此蛋白的基因 基因化学合成法 利用PCR法或RT-PCR分离基因,基因分离的物理化学方法,根据DNA分子的两条链存在着GC、A=T(分别代表GC间的三个氢键、 AT间二个氢键)碱基配对。如DNA分子中某段的GC碱基对含量高，则其热稳定性就高，即其熔解温度(Tm)值就高。这样，

27、人们可以通过控制熔解使富A=T区解链变性，而富GC区仍维持双链。当利用单链核酸酶s1酶去除解开的单链部分，得到富GC区的DNA片段。海胆rDNA基因的分离就是一例。,2.1目的基因的分离与制备,鸟枪法(shot gun),这一方法又叫霰弹法。这一方法是绕过特定基因分离这一关口，用生物化学方法，如用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上同一般基因大小相当的DNA片段(o81069106道尔顿)。然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌(如Ecoli)中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。,2.1目的基因的分离与制备,直接从基因组中分离目的基因的方法,

28、2.1目的基因的分离与制备,基因组文库法,以适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。,cDNA：具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。,2.1目的基因的分离与制备,cDNA文库法,以适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的

29、重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。,2.1目的基因的分离与制备,cDNA文库法,cDNA文库的建立方法,1分离表达目的基因的组织或细胞 2从组织和细胞中制备总体RNA和mRNA 3第一条cDNA链的合成 4第二条cDNA链的合成 (i)自身引导法(图1-15) (ii)cDNA第二条链的置换合成法(图1-41)。 (iii)引物一衔接头法合成双链cDNA (图1-42) 。 5cDNA的甲基化和接头的加入 6双链cDNA与载体的连接,第一条互补DNA链的合成需要RNA模板、cDNA合成引物、反转录酶、4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。,作为第一条链合成反应产物的cDNA

30、：mRNA杂交分子充当切口平移的模板。,基因的化学合成,1基因片段的全化学合成： 所谓基因片段的全化学合成是首先合成组成一个基因的所有片段，相邻的片段间有46个碱基的重叠互补，在适当的条件下(主要是温度条件)经退火后，用T4 DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因。,基因的化学合成,2基因的化学一酶促合成： 此方法的特点是不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相邻的3末端有一短的顺序相互补，在适当的条件下通过退火形成模板引物的复合体(template-primer complex)，然后在存在四种dNTP的条件下，用Ecoli的DNA聚合酶I

31、大片段(Klenow片段)去填补互补片段之间的缺口，最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶切割后重组入载体(图1-45)。,通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。,2.1目的基因的分离与制备,PCR法,PCR扩增法,2.2目的基因与载体的重组,黏性末端连接,平段连接,1、由同一种限制性核酸内切酶切割的不同DNA 片段具有完全相同的末端； 2、由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段具有相同类型的黏性末端；,2.2目的基因与载体的重组,黏性末端连接,2.2目的基因与载体的重组,如果目的基因的DNA片段是用

32、限制性内切酶切割并有黏性末端，则用同一种限制性内切酶处理载体DNA，使其成为黏性末端。切下的目的基因的片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成一个重组DNA分子。,2.2目的基因与载体的重组,平末端连接,连接平末端DNA分子的方法有4种： （1）直接用T4DNA连接酶连接； （2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接； （3）用衔接物连接平末端DNA分子； （4）DNA接头连接法。,（1）直接用T4DNA连接酶连接,2.2目的基因与载体的重组,平末端连接,（1） T

33、4DNA连接酶除了能够封闭具有3，一OH和5一P末端的双链DNA的缺口之外，在存在ATP和加入高浓度酶（10-100倍） 和低浓度的聚乙二醇PEG8000存在的条件下，它还能够连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分子。这种反应的原因目前尚不清楚。但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。 且外源DNA不能原位删除下来。,2.2目的基因与载体的重组,平末端连接,（2）同聚物加尾连接平末端DNA片段 运用末端核苷酸转移酶，能够将核苷酸(通过脱氧核苷三磷酸前体)，加到DNA分子单链延伸末端的3，一OH基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸

34、。,优点在于：不易自身环化，这是因为同一种DNA分子两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。用任何一种方法制备的DNA片段都可以用这种方法进行连接。 同聚物加尾法的不足之处：方法烦琐；外源片段难以回收。另外由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。还要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会重新产生某种核酸限制性内切酶的切点。,(3) 用衔接物连接平末端DNA分子 如果重组体DNA是用T4DNA连接酶的平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么就无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为

35、了解决这个问题，可采用衔接物法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。 所谓衔接物(linker)，是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。,2.2目的基因与载体的重组,平末端连接,衔接物的5，末端和待克隆的DNA片段5，末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来,2.2目的基因与载体的重组,平末端连接,（4）DNA接头连接

36、法 DNA衔接物连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。 当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的衔接物，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。,2.2目的基因与载体的重组,平末端连接,DNA接头(adapter)连接法于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末

37、端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。,2.2目的基因与载体的重组,平末端连接,2.3将重组体导入受体细胞,导入方法,1CaCl2处理后的细菌转化或转染。 2高压电穿孔法。 3聚乙二醇介导的原生质体转化法。 4磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。 5原生质体融合。 6脂质体法。 7细胞核的显微注射法。,1CaCl2处理后的细菌转化或转染。这是将重组的质粒或噬菌体DNA导入细菌中所用的常规方法，前者叫转化(transformation)后者叫转染(transfection)。作为受体细胞的细菌经一定浓度的冰冷CaCl2(50-100mmol

38、L)溶液处理后变成所谓感受态细胞(Competent cells)处在感受态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。,导入方法,注意以下几点：(a)用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在OD 600为04左右为好。(b)制备受体细胞的整个过程要在4进行，并尽量避免污染。如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。(c)为了提高转化率，可选用复合CaCl2溶液如“分子克隆”一书所介绍的FSB溶液。,导入方法,2高压电穿孔法。通过调节外加电场的强度、电脉冲的长度和用于转化的DNA浓度可将外源DNA导入细菌或真核细胞。用电穿孔法实现基因导入比CaCl2法方便，对细菌而言其转化

39、效率可达1091010转化体微克DNA，但必须有专门仪器,导入方法,3聚乙二醇介导的原生质体转化法。这种方法常用于转化酵母细胞以及其它真菌细胞。活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶(如driselase)处理变成球形体后，在适当浓度的聚乙二醇6000(PEG一6000)的介导下将外源DNA转化入受体细胞中。,导入方法,4磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。这是将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。用磷酸钙和DNA共沉淀方法时是将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞。,导入方法,5原生质体融合。通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺

40、乳细胞直接融合。经过细胞膜融合，细菌内容物转入动物细胞质中，质粒DNA被转移到细胞核中。 6脂质体法。将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。 7细胞核的显微注射法。即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中。,导入方法,2.4重组转化体的筛选和鉴定,(一)PCR法,根据含目的基因两端或两侧已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因。而采用DNA分子杂交的方法，只能在被杂交的DNA中存在目的基因的一部分DNA序列，就会出现杂交信号。,1菌落印迹原位杂交,将被筛选的菌

41、落或噬菌斑，从其生长的琼脂平板中通过影印方法，小心地原位转移到放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜上，并保存好原来的菌落或噬菌斑平板作为参照。将影印的硝酸纤维素滤膜，用碱液处理，促使细菌细胞壁原位裂解、释放出DNA并随之原位变性。然后80下烘烤滤膜，使变性DNA原位同硝酸纤维素滤膜形成不可逆的结合。将这块固定有DNA印迹的滤膜干燥后，同放射性标记的特异性DNA或RNA探针杂交，漂洗除去多余的探针，最后经放射自显影检测杂交的结果。含有同探针序列同源的DNA的印迹，在x光底片上呈现黑色的斑点，将胶片同原先保存的参照平板进行对照，即可确定阳性菌落或噬菌斑的位置，从而获得含有目的基因插入片段的重组础工业体

42、克隆。,(二)核酸杂交法,2斑点印迹杂交,斑点印迹杂交法与菌落印迹原位杂交的原理一样，但方法更简单、迅速，可直接将噬菌体的上清液或是由转化子提取的DNA(RNA)样品直接点在硝酸纤维素滤膜等固体支持物上，然后同核酸探针进行分子杂交。通过放射自显影，从底片中找出黑点即为阳性斑点。此方法常用于病毒核酸的定量检测。,(二)核酸杂交法,3Southern印迹杂交,它首先将初筛的重组DNA提取出来，用合适的核酸限制性内切酶将DNA切割，并进行凝胶电泳分离，然后经碱变性，利用干燥的吸水纸产生的毛细作用，让液体流经凝胶，使DNA片段由液流携带，从凝胶转移并结合在硝酸纤维素滤膜的表面，最后将此膜同标记的核酸探

43、针进行分子杂交。如果被检测DNA片段与核酸探针具有互补序列，就能在被检测DNA的条带部位结合成双链的杂交分子，并通过放射自显影显示出黑色条带来。,(二)核酸杂交法,(三)DNA测序法,进行目的基因的核苷酸测序。如果待测序的目的基因比较大，测序有困难，也可用RFLP(限制性片段长度多态性)技术。 用限制性内切酶对待克隆的目的基因和已克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果不一致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已发生了变化。经多种限制性内切酶切割分析，若两种结果都一样，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列没有变化。,(一)凝胶电泳检测法:利用凝胶电泳检

44、测重组质粒DNA分子的大小，也可以初步证明外源目的基因片段是否已插入载体。,(二)R环检测法:采用mRNA作探针，利用电子显微镜观察其核酸杂交结果。在临近双链DNA的变性温度下和高浓度(70)的甲酰胺溶液中，双链的DNARNA分子要比双链的DNADNA分子更为稳定。因此，当RNA探针及待测DNA的混合物置于这种退火条件下，RNA便会同它的购DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNARNA杂交分子，而使被取代的DNA链处于单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R环结构。,四、目的基因转录产物检测,用RNA印迹(Northern blotting)法检测。根据

45、转录的RNA在一定条件下可以同转录该种RNA的模板DNA链进行杂交的特性，制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总RNA杂交，若出现明显的杂交信号，可以认定进入受体细胞的目的基因转录出相应的mRNA。,五、目的基因翻译产物检测,最常用的是蛋白质印迹(Western-blotting)法。提取克隆子总蛋白质，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开后，转移到供杂交用的膜上，随后与放射性同位素或非放射性标记物标记的特异性抗体结合，通过一系列抗原抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存在目的基因表达产物。,一、基础理论研究： 基因的结构与功能。 基因的人工定点突变。 人类基因组计划

46、,2.5基因工程的应用,基因工程是一项非常复杂的技术操作，它的环节之繁多、操作之细致是其他工程所无法比拟的。但是如果抛开细节问题，基因工程操作流程还是比较明了的。它的基本步骤可以大致归纳如下：,小结,（1）获取目的基因，即用各种不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。,（2）获取基因载体。用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。,(3)重组DNA，即用人工方法，让目的基因与运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因

47、，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重组。从这里就可以看出工具酶的重要性，没有它们，重组工作就寸步难行。,（4）把重组DNA导入受体细胞进行扩增，即用人工方法，让携带着目的基因的运载体进入新的生物细胞里，让其增殖，由此形成重组DNA的无性生殖系（即克隆）。,（5）筛选与培育，即基因表达产物的鉴定、收集和加工等一系列复杂过程的综合。前几步工作是“播种”，这一步工作则是“收获”。“收获”工作比较复杂，这里不再介绍。,作 业,基因工程的定义、研究内容 基因工程研究的理论依据是什么？ 基因工程的工具酶有哪些？其

48、作用是什么？ 基因工程的载体有哪些？载体的功能有哪些？ Southern杂交、Northern杂交的概念是什么？ PCR技术的概念、原理及步骤 目的基因的制备方法有哪些？ 目的基因与载体重组过程中平末端连接方式有哪几种？,第三章 蛋白质工程,Protein Engineering,3-1蛋白结构基础和蛋白质工程的原理,蛋白质结构的基本构件,在自然界中，构成生命最基本的物质有蛋白质、核酸、多糖和脂类等生物大分子，其中蛋白质最为重要，核酸则最为根本。,各种生物功能、生命现象和生理活动往往是通过蛋白质来实现的，蛋白质不仅是生物体的重要组分，更重要的是它与生命活动有着十分密切的关系。 在体内，蛋白质执

49、行着酶催化作用，使新陈代谢能有序地进行，从而表现出各种生命的现象；通过激素的调节代谢作用，以确保动物正常的生理活动；产生相应的抗体蛋白，使人和动物具有防御疾病和抵抗外界病原侵袭的免疫能力；构建成的各种生物膜，形成生物体内物质和信息交流的通路和能量转换的场所。,蛋白质的生理功能 蛋白质是一切生命活动的体现者： 构成细胞和生物体的主要成分 调节作用：酶，部分激素（如胰岛素、生长激素） 运输作用：如血红蛋白、载体、肌红蛋白（贮氧） 免疫作用：如抗体 运动作用：如肌动蛋白、肌球蛋白 凝血：如纤维蛋白,蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为： 碳：5055；氢：6.07.0； 氧：2023；氮：1517； 硫：0.3