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1、第五章发酵工艺过程控制 第三节 pH对发酵的影响 及其控制 一、pH值对发酵的影响 二，发酵过程中pH的变化 三、发酵pH值的确定和控制,发酵过程的pH 值,pH值是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。,发酵过程中pH值是不断变化的，通过观察pH值变化规律可以了解发酵的正常与否,一、pH值对发酵的影响,pH值影响菌体的生长和产物的合成 pH值影响酶的活性： pH值影响微生物细胞膜所带电荷的状态： pH值影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解： pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变,如：pH对海藻糖水解酶产生的影响,pH菌浓 pH酶活,
2、又如： ：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响,pH在47范围内产酶高,漆酶(Laccases) 在漆树的永延液汁中可被此酶氧化变成黑色色素的物质是漆酚、氢化漆酚等。 借助氧将对苯二酚（氢醌）氧化成对苯醌的酚氧化酶的一种，亦称为对苯二酚氧化酶。 是一种结合多个铜离子的蛋白质，蓝色，分子量约12万，含4原子铜。属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。 漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。,pH影响菌体的生长,对微生物发酵来说有各自的最适生长pH值和最适生产pH值。 多数微生物生长都有最适pH
3、值范围及其变化的上下限： 上限都在8.5左右，超过此上限，微生物将无法忍受而自溶； 下限以酵母为最低(2.5)。,pH值影响酶的活性,当pH值抑制菌体某些酶的活性时会阻碍菌体的新陈代谢。 菌体生长和产物合成都是酶反应的结果，仅仅是酶的种类不同而已，因此代谢产物的合成也有自己最适的pH值范围。 一般认为，细胞内的H或OH能影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能，引起酶活性的改变。,培养基与胞内pH,培养基的H或OH并不是直接作用在胞内酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸(或弱碱)上，使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸(或弱碱)，它们进入细胞后，再行解离，产生H或OH，改变胞内原先存在
4、的中性状态，进而影响酶的结构和活性。所以培养基中H或OH是通过间接作用来产生影响的。,pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态,从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。 Collnig等人发现产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减小：其菌丝直径在pH6.0时为23m；pH7.4时为218m，并呈膨胀酵母状；pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。 菌体形态变化反映代谢,不同pH值对菌体的形态影响很大： 当pH值高于75时：菌体易于老化，呈现球状； 当pH值低于65时：菌体同样受抑制，易于老化。 而在72左右时：菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形； 在69左
5、右时：菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。,pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解： 从而影响微生物对这些物质的利用。,pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变 例 ：黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。 又如：谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺 由于PH值的高低对菌体生长和产物合成产生明显的影响，所以在工业发酵中，维持最适PH值已成为生产成败的关键因素之一。,（一）、发酵过程pH变化的原因 培养基中营养物质的代谢，是引起pH值变化的主要原因 1、基质代谢 （1）糖代
6、谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇， 使pH下降。 糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。 （2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降； 尿素被分解成NH3，pH上升， NH3利用后pH下降， 当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。,二，发酵过程中pH的变化,生理碱性物质、生理酸性物质,无机氮源特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。 生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺。 生理碱性物质：若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。,生理碱性物质、
7、生理酸性物质,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。 (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH值有积极作用。,2.培养基 引起pH值下降的因素 碳源过量 消泡油添加过量 生理酸性物质的存在 引起pH值上升的因素 氮源过多 生理碱性物质的存在 中间补料，碱性物质添加过多,发酵过程pH值变化的原因,如： 培养基对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4
8、或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。 对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。 发酵15小时左右，pH值可以从稍后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH保持7.0，可提高发酵单位。,pH,7.0,t,不调pH,调pH,效价,pH,3、产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。 如有机酸类产生使pH下降； 红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,4、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,发酵过程pH变化的原因,1
9、.pH的确定根据实验结果,配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况,pH对产海藻酸裂解酶的影响,三、发酵PH值的确定和控制,菌体有一定的自调pH值能力,在产生菌的代谢过程中，菌体本身具有一定的调整周围环境pH值，构建最适pH值的能力。 曾以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究，采用pH值为6.0、6.8、7.5三个出发值，结果发现pH值在6.8、7.5时，最终发酵pH值都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平； 但pH值为6.0时，发酵中期pH值只达4.5，菌浓仅为20，发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。,pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,pH对菌
10、体生长影响比产物合成影响小（同温度） 例 青霉素：菌体生长最适pH3.56.0, 产物合成最适pH7.27.4 四环素：菌体生长最适pH6.06.8， 产物合成最适pH5.86.0,XP,pH,四环素,在不同的发酵阶段所要求的pH值不同,如：谷氨酸 发酵前期：控制pH=7.5左右 发酵中期：控制pH=7.2左右 发酵后期：控制pH=7.0左右 将近放罐时： pH=6.56.8为好 如：初级代谢产物丙酮、丁醇的梭状芽孢杆菌的发酵 pH在中性时，菌体生长良好，但产物产量低。 实际发酵合适pH值为56。 又如：次级代谢产物抗生素发酵 链霉素产生菌生长的合适pH值为6.27.0， 而合成链霉素的合适p
11、H值为6.87.3。 因此按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围，使产物的产量达到最大 。,最适pH值的确定,生长最适pH值的确定： 将发酵培养基调节成不同的出发pH值进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节pH值以维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基来维持之。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的最适pH值。 产物合成的最适pH值的确定： 以同样的方法，可测得产物合成的最适pH值。,最适pH值确定的条件,但同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。 如：合成青霉素的最适pH值，先后报告有7.27.5、7.0左右和6.56.6等不同数值，产
12、生这样的差异，可能是所用的菌株、培养基组成和发酵工艺不同引起的。 在确定发酵最适pH值时，要不定期考虑培养温度的影响，若温度提高或降低，最适pH值也可能发生变动。,2、pH的控制,A. 和Qp的最适pH值的 几种情形 在各种类型的发酵过程中， 实验所得的最适pH值 菌体的比生长速率和 产物比生成速率Qp等 3个参数的相互关系有四种情况： (a) 和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内，这种发酵过程易于控制；,(b) Qp的最适pH值范围很窄，而的范围较宽；或反之。 (c) 和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的。 第三种情况的发酵pH值应严格控制； (d)第四种情况更复杂
13、，和Qp有各自的最适pH值，应分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。,B .控制方法,首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。 （1）调节好基础料的pH。 基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.56.8。 （2）在基础料中加入维持pH的物质。 如代谢产酸物质：葡萄糖（产酮酸）、（NH4)2SO4 产碱物质：NaNO3、尿素 缓冲剂：CaCO3、磷酸缓冲液等,在发酵过程中根据糖、氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH 如 调节补糖速率；消泡剂(如豆
14、油)的个别情况下， 还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，来 调节pH 当NH2-N低，pH低时补氨水； 当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4 当补料与调pH发生矛盾时，加酸 碱调pH,（3）、通过补料调节pH,分别在4种缓冲介质中，于pH 650一950测定天冬酰胺酶酶活力 1 甘氨酸介质pH 8.00时酶活力最高； 2 硼酸在pH 850，酶反应最快 3 磷酸在pH 850，酶反应最快 4 Tris（三羟甲基氨基甲烷）在pH 850，酶反应最快 酶活1243,C、不同调节pH方法产生的影响,不同缓冲介质对天冬酰胺酶的影响,不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的
15、影响，结果如图所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值， “2”表示只加尿素控制， “3”表示CaC03和尿素联合控制pH值。,异亮氨酸发酵,例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）,菌株最适生长pH控制在6.87.0,D、发酵的不同阶段采取不同的pH值,pH69时：菌体生长旺盛， pH715时：对菌体的产酸有利。 因此，采用阶段pH控制模式进行发酵： 发酵中前期：控制pH6.9， 到48h后： pH值为7.15， 到80h后： pH值为7.25。 产率2227g/L，产酸率提高1223。,例：克拉维酸发酵中pH变换控制,问题的提出： 在pH低时 : 菌体生长受抑制， 在高pH时 :
16、 克拉维酸会分解,用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现: 前期:由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH7 降至6.5。 达到最高细胞浓度后: pH开始从6.5升至8.3。 CA产量达最高水平时: pH不再升高。 在发酵终止时: pH再次升至8.5。随着pH升高，CA迅 速分解。,克拉维酸对各种-内酰胺酶有强抑制作用。生产菌为棒状链霉菌 。,研究不同pH对克拉维酸Clavulanic Acid发酵的影响 分别配置pH为6.0，7.0，8.0的培养基, 并控制稳定 测定菌的生长和产物合成,pH6.0时，生长受抑制，产物生成少,细胞 克拉维酸,细胞 克拉维酸,控制pH7.0和8.0时，最高细胞浓
17、度接近相同(约16PMV)。 在25升生物反应器内， 不控制pH时产率247g(m1h ) 控制pH7.0时的产率337g(m1h) 最高 控制pH8.0时，产率202g(m1h) 在控制pH60时，CA产生被抑制,但降解少 因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0，但在控制pH7.0时，仍出现CA的迅速分解。,由于 CA生产的最适pH 减少CA分解的pH 因此在分批发酵中应用了pH变换策略， 使发酵pH由中性pH70变换为酸性pH6.0。 在发酵前期：在细胞生长和产生CA期间控制 pH7.0，4d。 当CA产量达最高值时：变换pH为6.0，以减少CA分解。 最高CA浓度可保持24h。 由于改变pH，使CA分解速率明显降低。,各不相同,pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。,总结,什么是呼吸商？,