第二章糖和苷.ppt

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1、第二章 糖和苷,厦门大学医学院药学系 丘鹰昆 ,本章基本内容,概述 结构类型 糖苷分类 糖和苷的物理性质 糖的化学性质 苷键的裂解 糖的提取分离 糖的鉴定和糖链结构的测定,基本概念,糖类（saccharide） 亦称碳水化合物（carbohydrate） 是植物光合作用的初生产物 同时也是绝大多数天然产物合成的初始原料 苷类（glycosides） 亦称苷或配糖体 是由糖或糖衍生物与另一非糖物质 (苷元, aglycone或配基, -genin) 通过糖的半缩醛或半缩酮羟基与苷元，脱水形成的,简介,分布广泛，常常占植物干重的8090% 主要活性：抗肿瘤、抗肝炎、抗心血管疾病、抗衰老等 例：人参

2、、灵芝、黄芪、枸杞子、香菇、刺五加 生命活动所必需的四大类化合物 糖类、核酸、蛋白质、脂质,第1节 单糖的立体化学,1、单糖的立体结构表示法,单糖 多羟基醛 (酮)类 水溶液中主要以环状半缩醛 (酮)形式存在 理论上，有多个位置上的OH可与C=O成环 由于环张力因素，自然界的糖存在形式为 5元氧环 (呋喃型糖，furanose) 6元氧环 (吡喃型糖，pyranose) 成苷后，缩 (酮)结构固定 单糖结构的3种表示方法 Fischer投影式 Haworth投影式 优势构象式,Fischer投影式,基本规则 主C链上下排列 氧化程度高的在上 横前竖后 缺点：不能真实表示单糖在水溶液中半缩醛 (

3、酮)的环状存在形式,D-葡萄糖,2、Fischer与Haworth式的改换,Fischer式与Haworth式的改换 Fischer式成环 保证环张力最小 成环C取代基发生了旋转: H的位置发生的变换 Fischer式右侧的在环下 Fischer式左侧的在环上,Fischer式与Haworth式的改换,3、单糖的绝对构型 (D、L),以-OH甘油醛为标准，将单糖分子的编号最大的不对称C原子的构型与甘油醛作比较而命名分子构型的方法,Fischer式,Fischer式中，最后1个手性C上的OH 向右的为D型 向左的为L型,Haworth式,最后1个手性C参与成环 依据最后1个手性C ：C5 (吡喃

4、糖)或C4 (呋喃糖)上大取代基的方向 向上为D型 向下为L型 最后1个手性C (原构型标准) 未参与成环 依据该手性C原有构型判断 呋喃型已醛糖 吡喃型戊醛糖 吡喃型已酮糖,呋喃型已醛糖，C5-C6部分成为环外侧链 C5-R者为D型 C5-S者为L型,吡喃型戊醛糖 (C4-OH) 、吡喃型已酮糖 (C5-OH) 环上者为L构型: S构型 环下者为D构型: R构型,4、单糖的相对构型 (,),C1-OH与最后1个手性C C5 (六碳糖)或C4 (五碳糖)上取代基间的相对构型 Fischer式 顺式为 反式为 Haworth式 同侧为 异侧为,最后1个手性C (原构型标准) 未参与成环的Hawo

5、rth式 先判断糖D、L构型，再判断、 习惯上D型糖中C1-OH 处环上者为体 环下者为体 在L型糖中相反 处环上者为体 环下者为体,5、单糖的优势构象式,Angyal用总自由能来分析构象式的稳定性，比较二种构象式的总如：葡萄糖的自由能差值，能量低的是优势构象。 二种构象式的比较：,第2节 糖和苷的分类,1、单糖类,已发现的种类 200多种 38个C，其中五、六碳糖最多 存在形式 多为结合状态 仅有葡萄糖、果糖等少数为游离存在 词根 呋喃糖 -furanose 吡喃糖 -pyranose 配基 -genin 苷 -oside 糖 -ose 糖醛酸 -uronic acid 氨基糖 -samin

6、e 糖醇 -itol,1) 五碳醛糖 (aldopentose),L-阿拉伯糖 (L-arabinose, Ara) D-木糖 (D-xylose, Xyl) D-核糖 (D-ribose, Rib),2) 六碳醛糖 (aldohexose),D-葡萄糖 (D-glucose, Glc) D-甘露糖 (D-mannose, Man) D-半乳糖 (D-galactose, Gal) D-阿洛糖 (D-allose, All),3) 六碳酮糖,D-果糖 (D-fructose, Fru) L-山梨糖 (L-sorbose),4) 甲基五碳醛糖,L-鼠李糖 (L-rhamnose, Rha),5)

7、 支碳链糖,D-芹糖 (D-apicose, Api),6) 氨基糖 (amino sugar),是指单糖的伯或仲醇基置换成氨基的糖类 主要存在于动物和微生物中 龙虾甲壳中得到的葡萄糖胺 (2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖)为第1个发现的 天然存在的大多为2-氨基-2-去氧醛糖 氨基取代后往往对药理活性有较大的影响,7) 去氧糖 (dexylsugars),单糖分子的12个OH为H原子代替的糖 常见6-去氧糖、2,6-二去氧糖 主要存在于强心苷和微生物代谢产物中,8) 糖醛酸 (uronic acid),单糖分子中伯醇基氧化成羧基的化合物 存在于多糖、苷中 常见的类型：葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 糖

8、醛酸在水溶液中易环合成内酯，以平衡状态存在,9) 糖醇,单糖的醛或酮基还原成OH后所得的多元醇 自然界分布很广 有的具有甜味 D-山梨醇 (D-sorbitol) D-甘露醇 (D-mannitol) D-木糖醇 (D-xylitol),木糖醇的制备 玉米芯、花生壳、甘蔗渣中含有多聚戊糖，将其粉碎，加硫酸、水加热，水解生成木糖精制催化加氢，就得到木糖醇,10) 环醇 (cyclitols),环状多羟基化合物，从生源看属单糖衍生物 游离或成苷 具有很好的水溶性 环六醇 (肌醇，inositols)，9个异构体,2、低聚糖类 (oligosaccharides),定义 2 9 个单糖分子 通过苷键

9、结合而成的 直链或支链聚糖 分类 糖个数：双糖、三糖 是否具有游离醛、酮C=O 还原糖 非还原糖 如： 蔗糖 (sucrose) -D-葡萄糖-(12)-D-果糖 麦芽糖 (maltose) -D-葡萄糖-(14)- -D-葡萄糖,环糊精,环糊精 (cyclodextrin) 由Bacillus macerans等菌产生的一种淀粉，可将淀粉水解为68个葡萄糖以1,4-环状结合的低聚糖 6、7、8聚体称为：、-环糊精 特点 良好水溶性 分子内侧具有疏水性，可包合脂溶性药物 由于具有多个手性中心，可用于手性分离,低聚糖的简明表示方法,p: 吡喃型 f: 呋喃型 更正： p67文字 p 68图,3、

10、多糖类 (polysaccharides),10个以上单糖通过苷键结合而成 按生物体内功能分类 动植物的支持组织：纤维素、甲壳素等 不溶于水 分子呈直线型 动植物用于贮存养料的：淀粉、肝糖元等 可溶于热水成胶体溶液 分子呈支链型 按单糖组成分类 (-an) 均多糖：由1种单糖组成 葡聚糖 (glucan), 果聚糖 (frucan) 杂多糖：由2种以上单糖组成 葡萄甘露聚糖 (glucomannan), 半乳甘露聚糖 (galactomannan) 许多多糖还含有O-乙酰基、N-乙酰基、磺酸酯等,几个重要的多糖,香菇多糖：抗肿瘤 人参多糖：抗肿瘤、抗突变 女贞子多糖：免疫增强 茶叶多糖：抗凝血

11、、抗血栓、降血脂,1) 植物多糖,淀粉 (starch) 由直链淀粉 (糖淀粉) +支链淀粉 (胶淀粉)组成 糖淀粉：(14)连接D-葡聚糖，溶于热水得澄明溶液，占1734% 胶淀粉： (14)或(16)连接D-葡聚糖，溶于热水呈粘胶状 呈螺旋状，每个螺环6个葡萄糖分子 碘分子、离子可进入螺环通道，形成有色的包结化合物显色 平均聚合度越大，颜色越深 糖淀粉：蓝色 胶淀粉：因为有分支，平均聚合度只有2025，呈紫红色 纤维素 (cellulose) 聚合度30005000的(14)结合直链葡聚糖 直线状 人、肉食动物所含的-苷酶很少，故无法吸收 利用 微生物、原生动物、反刍动物可利用,果聚糖 (

12、fructans) 菊淀粉 (inulin): D-Fru-(24)-D-Glc, 聚合度35，可用于测定肾清除率 levans: D-Fru-(26)-D-Glc，也有(21)分支 半纤维素 (hemicellulose) 杂多糖 可被碱水溶解的酸性多糖：支链上多有糖醛酸 树胶 (gum) 粘液质 (mucilage)、粘胶质 (pectic substance),2) 动物多糖,糖原 (glycogen) 结构类似淀粉，但聚合度较大、分支更高 遇碘：红褐色 甲壳素 (chitin) 由N-乙酰葡萄糖胺通过(14)连接而成 结构、稳定性与纤维素类似,酸性粘多糖 (acid mucopolys

13、accharide) 亦称：糖胺聚糖 (glycosaminoglycan) 由氨基己糖+糖醛酸组成的杂多糖 如： 肝素 硫酸软骨素 透明质酸 常以蛋白质结合状态存在，统称：蛋白聚糖,酸性粘多糖,肝素 (heparin) 由2种二糖单元A、B聚合而成 高度硫酸酯化的右旋多糖，糖链上常接有丝氨酸、小肽 很强的抗凝血作用 硫酸软骨素 (chondroitin sulfate) 降血脂作用 动物组织的基础物质：包括A、B、C数种 A：软骨的主要成分 B：硫酸皮肤素，半乳糖胺L-伊杜糖醛酸双糖聚合物 透明质酸 (hyaluronic acid) 存在于眼球玻璃体、关节液中的酸性粘多糖 润滑、缓冲作用,

14、4、苷类,糖与非糖组成的化合物苷 分类 按苷原子不同分类：O、S、N、C-苷 按苷元不同分类：黄酮苷、蒽醌、香豆素、强心苷、皂苷 按端基碳构型分 苷，多为L型； 苷，多为D型。 按连接单糖个数分：单糖苷、双糖苷、叁糖苷 按糖链个数分 1个位置成苷单糖链 2个位置成苷双糖链 按生物体内存在分 原级苷在植物体内原存在的苷 次级苷原级苷水解掉一个糖或结构发生改变,1) O-苷,按苷键不同分类 醇苷 是通过醇羟基与糖端基羟基脱水而成的苷 酚苷 是通过酚羟基而成的苷 酯苷 苷元以-COOH和糖的端基碳相连接的是酯苷 氰苷 -羟腈苷 己发现50多种 -羟腈苷 氧化偶氮类,醇苷,红景天苷 (rhodiolo

15、side) 强壮增强适应力 毛茛苷 (ranunculin) 杀虫、杀菌 京尼平苷 (geniposide) 栀子 泻下、利胆 甘草酸 抗肿瘤 海星环苷,酚苷,天麻苷 (gastrodin) 镇静 番泻苷A (sennoside A) 泻下 芦丁 (rutin) 软化血管 秦皮素 抗菌,氰苷 (cyanogenic glycoside),-羟氰苷 体内产生HCN发挥镇咳作用，过量死亡 服用乳糖竞争体内的-葡萄糖苷酶预防中毒、提高LD50,氰苷,-羟氰苷 垂盆草苷：降低谷丙转氨酶 稀碱，水解异垂盆草苷 氧偶氮苷类 苏铁苷 (cycasin)、新苏铁苷 (neocycasin) 肝脏内代谢CH2N

16、2毒性,酯苷 (酰苷),酯苷的苷键 酯的性质 缩醛的性质,吲哚苷,靛苷 (indicant) 菘蓝苷 (isatan B),2) S-苷,萝卜苷 (glucoraphenin) 黑芥子苷 (sinigrin) 白芥子苷 (sinalbin),3) N-苷,腺苷 (adenosine) 鸟苷 (guanosine) 胞苷 (cytidine) 尿苷 (uridine) 巴豆苷 (crotonoside),4) C苷,活性C，电子云密度高，易形成C苷 苷元多为间苯二酚、间苯三酚 主要为黄酮、查耳酮、蒽醌、蒽酮、酚酸等 化学性质：难以水解 消化道中的部分微生物可以水解,第3节 糖的化学性质,物理性质

17、,溶解性 糖 小分子极性大，水溶性好 单糖极性 双糖极性 与-OH/C的分担情况而定 聚合度增高水溶性下降 多糖难溶于冷水，或溶于热水成胶体溶液 苷：亲水性 与连接糖的数目、位置有关 苷元：亲脂性 味觉 单糖低聚糖：甜 多糖：无甜味 随着糖的聚合度增高，则甜味减小 苷类：苦、甜等，人参皂苷、甜菊苷,旋光性,旋光性 具有加和性，可用于苷键构型的测定 M=+A+B M=-A+B 端基C的旋光贡献 C1=1/2 (MM) 规则 1对糖或苷的端基异构体分子旋光差为2A，只与端基旋光性有关 分子旋光和2B：只与下端有关，与端基C无关 D系糖型比型更右旋 L系糖型比型更左旋,Klyne法 将苷和苷元的分子

18、旋光差 与组成该苷的糖的一对甲苷的分子旋光度进行比较 数值上相接近的一个便是与之有相同苷键的一个 摩尔旋光度M=M/100=M/(100cL),一、氧化反应,单糖基团的活泼性顺序 半缩醛 (酮) 伯醇 仲醇 2-OH 3,4-OH e键-OH a键-OH 反应条件与产物 -CHO-COOH 银镜反应：Ag+Ag 弗林反应：Cu2+Cu2O 砖红色 Br2/H2O ：褪色 HNO3: 醛糖糖二酸 HIO4、Pb(Ac)4氧化：邻二醇-OH,过碘酸反应,主要作用于 邻二醇 -氨基醇 -羟基醛(酮): 反应较慢 邻二酮：反应最慢 某些活性次甲基等结构,反应特点,反应条件 含水溶液（否则不反应） 避光

19、 反应特点 反应定量进行 降解产物稳定 生成的HIO3可滴定 反应速度 顺式 反式 中、酸性条件下：顺式易形成环式中间体 碱性条件下：速度相差不大 吡喃糖 呋喃糖 在异边而无扭转余地的邻二醇不起反应,反应机制,与邻二醇形成五无环状酯中间体 HIO4形成离子 pH7: HIO4H2IO5-，6面体 a,e-OH可通过半船式扭曲共平面 e,e-OH无法共平面 pH7: HIO4H3IO62-，8面体 a,e; e,e-OH均可形成中间体 形成中间体 将-OH氧化为C=O,HIO4消耗量的确定,单糖：按Fischer式计算 成苷：按Haworth式某处 活性CH2：多消耗1分子HIO4,用途,推测糖

20、中邻二-OH多少 推测吡喃糖、呋喃糖 推测低、多聚糖聚合度 推测1,3连接还是1,4连接 糖与糖连接的位置,Pb(Ac)4氧化,氧化能力较HIO4强 室温下可氧化草酸 立体选择性更高 呋喃糖反式二醇OH不能氧化 需要在有机溶剂中进行 HAc, 二氧六环 多糖类物质使用受限,二、糠醛形成反应,Molish反应,样品 + 浓H2SO4 + -萘酚 棕色环 多糖、低聚糖、单糖、苷类Molish反应= ？,三、羟基反应,反应活性 最高的半缩醛羟基（C1-OH） 其次是伯醇基（C6-OH） 仲醇次之 伯醇因其处于末端的空间，对反应有利，因此活性高于仲醇 反应类型：醚化、酯化和缩醛（酮）化,1、醚化反应

21、(甲基化),Haworth法（不常用） 含糖样品 + Me2SO4 + 30%NaOH 醇-OH全甲基化 需反复68次 判断反应是否完全的方法：IR测试直到无-OH吸收峰为止 用途：制备成甲苷，用限量试剂，即克分子比11时，可得甲苷 Purdie法 样品 + MeI + Ag2O 全甲基化 (醇-OH) 只能用于苷，不宜用于还原糖 (即有C1-OH的糖)，Ag2O有氧化作用C1-OH氧化 Hakomori法 (箱守法) 样品 + DMSO + NaH + MeI 全甲基化：一次即可 该反应是在非水溶剂中，即二甲基亚砜（DMSO）溶液中进行反应 重氮甲烷法 (CH2N2) 样品 + CH2N2

22、/ Et2O + MeOH 得到：部分甲基化产物，-COOH、-CHO等,2、酰化反应 (酯化反应),OH活性与甲基化反应相同 即：C1-OHC6-OHC3-OH 由于C2位取代后空间障碍C3-OH最难 用途 判断糖上-OH数目 保护-OH等,3、缩酮和缩醛化反应,酮或醛 + 多元醇 (有2个有适当空间位置的OH) 脱水剂如矿酸、无水ZnCl2、无水CuSO4等存在下 形成环状缩酮 (ketal)和缩醛(acetal) 酮类易与顺邻-OH生成五元环状物 醛类易与1,3-双-OH生成六元环状物 目的:保护-OH,糖 + 酮,糖 + 丙酮 五元环缩酮 (异丙叉衍生物) 有顺邻-OH时五元环状物 无

23、顺邻-OH时转变为呋喃糖结构是再生成五元环状物,糖 + 醛,糖 + 苯甲醛 六元环状缩醛 (苯甲叉衍生物) 葡萄糖甲苷 + 苯甲醛 具1,3-OH结构,四、羰基反应,还原糖 + 苯肼 糖腙 (易溶于水) + 2分子苯肼 糖脎 (难溶于水) 2-去氧糖不能成脎：C2上无-OH 应用：糖的鉴定、分离和纯化,五、硼酸络合反应,糖的邻二-OH可与许多试剂生成络合物物理常数的改变有助于糖的分离、鉴定和构型推定 重要的如：硼酸络合物、钼酸络合物、铜氨离子络合物等 糖 + 硼酸 络合物 (酸性增加、可离子化) H3BO3是接受电子对的Lewis酸 中性酸性，应用 酸碱中和滴定 离子交换法分离 电泳鉴定 可在

24、混有硼砂缓冲液的硅胶薄层上层析,第4节 苷键的裂解,了解苷元结构、糖的组成、连接方式 方法 酸催化水解反应 乙酰解反应 碱催化水解和消除反应 酶催化水解反应 氧化开裂法（Smith降解法）,一、酸催化水解,苷键属于缩醛结构，易为稀酸催化水解 苷原子先质子化 断键生成阳碳离子或半椅型的中间体 水中溶剂化而成糖,酸水解的规律 (总),总规律 (反应容易) 苷原子的电子云密度 质子化位阻 环张力 (稳定性),酸水解的规律 (具体),苷键 N O S C苷 酰亚胺苷？ 构型 苷元为小基团 ( e a )：质子化位阻小 苷元为大基团 ( a e )：稳定性 苷元 酚苷、烯醇苷 醇苷 醇苷：叔OH仲OH伯

25、OH 糖 取代基的I效应 2,3-二去氧糖 2-去氧糖 3-去氧糖 羟基糖 糖醛酸2-氨基糖 糖醛酸：难 (-I效应) 氨基糖：难 (-NH2-NH3+，强烈-I效应) 呋喃糖吡喃糖；酮糖醛糖 (稳定性、张力) 糖a键多：易 (稳定性) C5-取代基大小：越大越难 (质子化位阻) 七碳糖 六碳糖甲基五碳糖 五碳糖,酸水解的方法,酸水水解法 5%HCl 得到游离的糖 苷元构型易改变 两相水解法 酸水+CHCl3 (有机相) 水层：糖 有机层：苷元，构型保持不变 温和酸水解 0.3% HCOOH, CH3COOH 选择性开裂易开裂的苷键 盐酸甲醇水解 5%HCl+MeOH 直接醚化半缩醛OH：能够

26、确定糖氧环大小 (呋喃、吡喃),二、乙酰解反应,试剂：醋酐 + 酸 H2SO4、HClO4、CF3COOH Lewis酸 (ZnCl2、BF3) 反应条件：一般是在室温放置数天。 反应机理 与酸催化水解相似 但以CH3CO+为进攻基团 用途 保护苷元上的-OH、增加亲脂性 部分开裂苷键：鉴别多糖连接方式,反应规律,易发生异构化 糖的端基 糖cis-C2, 3-OH 反应速率 电子云密度容易 苷键周围有电负性强的基团 (如环氧基)：难 -苷键易断 -苷键的葡萄糖双糖的反应速率 (16) (14) (13) (12),乙酰化 OH电子云密度难 伯OH仲OH叔OH酚OHCOOH,三、碱催化水解,一般

27、苷键对稀碱是稳定的，但苷元上有吸e基团直接与苷原子相连时，易为碱水解 酯苷 酚苷 烯醇苷 -吸电子基取代的苷：-消除反应,C1-OH与C2-OH 反式易水解1,6-葡萄糖酐 发生了二次Walden转换 顺式正常的糖 * 利用水解产物可判断苷键构型,-消除反应,苷键-位有吸e基团-H活化利于OH-进攻与苷键共同发生消除开裂 例：()-CN,糖还原端，游离的CO活化邻位H 与3-O-或4-O-苷键起消除反应 碱使多糖还原端单糖逐个剥落，对非还原端无影响 生成的是-脱氧糖酸 用途：从生成的糖酸了解还原糖的取代方式 3-O-代的糖可3-脱氧糖酸 4-O-代的糖可3-脱氧-2-羟甲基糖酸 二个以上取代的

28、还原糖难生成糖酸,四、酶催化水解反应,酶专属性高，选择性地催化水解某一构型的苷 苦杏仁酶 (emulsin)：-6C醛糖苷 蜗牛酶：-苷键 纤维素酶 (cellulase)：-D-葡萄糖苷 麦芽糖酶 (maltase)：-D-葡萄糖苷 转化糖酶 (invertase)：-D-果糖苷 酶：提取纯化困难，使用微生物代替 用途 判断苷键构型 得到的苷元保持结构不变 提取分离时，注意杀酶保苷!,五、氧化开裂法 (Smith降解法),试剂: HIO4 (NaIO4)+ NaBH4 + 稀H+ 反应条件温和，可得到原苷元 不适用于含邻二醇OH的苷元 可用于C苷的水解,具真正的缩醛结构 很弱的酸即可水解,例

29、：人参皂甙Rb1水解,C苷的Smith裂解,HIO4 (NaIO4)+ NaBH4 + 稀H+ R-CHO FeCl3 糖C1，C2间开裂的产物 例：葡萄糖碳苷阿拉伯糖,六、糖醛酸苷的选择性水解,由于酸水难水解，反应剧烈苷元破坏 光解法 Pb(Ac)4分解 法 醋酐-吡啶分解法 微生物培养法 醚键相连的苷 水解无法得到苷元 例：芍药新苷 (lactiflorin),第5节 糖的NMR性质,其它波谱学特征,IR -葡萄糖苷在770、780 cm-1有强吸收峰 MS 葡萄糖苷乙酰化物331碎片峰强度： ,一、1H-NMR,非信号峰 TMS 溶剂峰 D2O溶剂 4.8，可能会影响端基质子信号 随T改

30、变而改变：-0.01/K 水峰：4.8 杂质峰：看积分比,化学位移,端基质子：4.36.0 黄酮3-D-Glc: 5.36.0 黄酮其它位置的-D-Glc: 4.85.2 醇苷：4.8 其它质子: 3.24.2 甲基5C糖: 1.0 (-CH3),邻偶 (vicinal coupling): Jvic, 3J,饱合型化合物 开链脂肪族化合物由于键自由旋转的平均化，使3J数值约为68Hz 3J与键长、取代基电负性、两面角等因素相关 两面角：3J = 4.2 - 0.5cosf + 4.5cos2f 邻位电负性， 3J ： 3J =7.9-n0.7Dx Dx: 取代基与H电负性的差值,端基质子的J

31、值与构型,J值确定糖端基的构型 对于2-H处于a键的糖 68 Hz: H1处于a键 24 Hz: H1处于e键,2-H处于e键的糖：甘露糖、来苏糖、鼠李糖等 a-e, e-e两面角为60或120 J值相近 (05 Hz ) 无法判断,! 鼠李糖优势构象：1C式,二、13C-NMR,化学位移 -CH3：18 CH2OH：62 CHOH：6885 呋喃糖C3、C5：多80 端基C：95105 100：多数的-D、-L苷 少数降为98：酯苷、酚苷 (注意1H-NMR的数值)、叔醇苷 100：多数的-D、-L苷 *特殊：D-arabinose,1JC1-H1与苷键构型,吡喃糖 C1式 165 (170

32、175) Hz: -D、-L 1C式：鼠李糖，相反! -L： 160170 Hz -L： 150160 Hz 呋喃糖：无法判断,苷化位移 (glycosidation shift),定义 糖苷化后 端基碳 多向低场移动 酯苷：稍向高场! 醇苷元 -C：向低场移动 -C：多向高场移动 酚、酯苷元 -C：向高场移动 -C：稍向低场移动 其余碳的影响不大 这种苷化前后的化学变化，称苷化位移,苷元位有取代时的苷化位移,苷元-碳和糖端基手性相同(同为R或S)时：与苷元为-无取代的环醇相同 苷元-碳和糖端基碳手性不同时：苷化位移值增大3.5,例：齐墩果酸,13C-NMR的取代基位移,-OH的甲基化位移 无

33、论醇、酚-OH，甲基化后，-C低场位移，-C高场位移,13C-NMR的取代基位移,-OH的酰化位移 醇-OH： -C低场位移，-C高场位移 酚-OH： -C高场位移，-C低场位移,第7节 糖和苷的提取分离,一、提取,杀酶保苷 采集新鲜材料 迅速加热干燥；冷冻保存 溶剂法：水；稀醇 (单糖、低聚糖、多糖) 糖类: 冷热水、冷热稀醇 苷类: 根据极性大小，选择相适应的溶剂,蛋白质除去法,粗多糖，常夹杂有较多的蛋白质 方法 Sevag法 CHCl3+戊醇(丁醇)+多糖水溶液 5：1：25剧烈振摇20 min离心，除去两相间的变性蛋白 温和，但要重复5次 三氟三氯乙烷法 多糖水溶液+CF3-CCl3

34、1:1搅拌10 min离心取水层，2次 温和 三氯醋酸法 多糖水溶液，滴加3%CCl3COOH至不继续混浊为止510过夜离心除沉淀 酶解法 多糖水溶液+胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链蛋白酶等 糖Pr的处理 硼氢化钾+稀OH- 注意：处理时间要短，温度要低 避免多糖降解,二、分离,季铵氢氧化物沉淀法 分级沉淀或分级溶解法 活性炭柱色谱 纤维素色谱 离子交换柱色谱 凝胶柱色谱 制备性区域电泳 * 蛋白质除去法 (提取),1、季铵盐沉淀法,季铵盐&氢氧化物 是一类乳化剂 可与酸性多糖形成 溶液pH或含硼砂缓冲液 (糖酸性)中性多糖 常用的季铵盐 CTAB (十六烷基三甲胺溴化物)&氢氧化物 (C

35、TA-OH) CP-OH (十六烷基吡啶) 操作 110% CTAB或CP-OH，搅拌下滴加于0.11% 多糖溶液中 (pH9, 无硼砂) 酸性多糖 控制季铵盐浓度，可分离不同的酸性多糖,2、分级沉淀、分级溶解法,糖水溶液，逐步加乙醇 (丙酮)各部分 多糖通常在pH=7时进行 酸性多糖在pH=24时进行 为防酸水解苷键，操作宜迅速 制成醚化、乙酰化产物，溶于醇 分步+小极性溶剂(乙醚),3活性炭柱色谱,用途：分离水溶性物质 氨基酸、糖类及某些苷类 特点 上样量大，分离效果较好，适合大量制备 来源容易，价格低廉 缺点：无测定其吸附力级别的理想方法 分类 粉末状活性炭：颗粒细，总表面积大，吸附力及

36、吸附量大 颗粒状活性炭：颗粒较大，吸附力、吸附量次之 绵纶-活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉末状活性炭制成颗粒，吸附力最弱,吸附规律,吸附规律 MW，吸附力：多糖 单糖 洗脱顺序 水有机溶剂 (EtOH) H2O10%20%30%50%70%EtOH 无机盐单糖 二糖 三糖 多糖,4、纤维素色谱,原理 与PC相同，属分配层析 溶剂系统：水、丙酮、水饱和的正丁醇等 洗脱顺序 水EtOH 水溶性大先出 无机盐单糖 二糖 三糖 多糖,5、离子交换柱色谱,纤维素改性离子交换纤维素 阳离子：CM-cellulose等 用于分离：酸性、中性、粘多糖 洗脱剂：pH相同，离子强度不同的缓冲液 吸附力 (变大) 酸

37、性基团多 MW大 直链 阴离子：DEAE-cellulose等 中性多糖硼酸络合物 洗脱剂：不同浓度硼酸盐液,6、凝胶柱色谱,常用商品名称及型号 葡聚糖凝胶：Sephadex G-10、G-15、G-200等 10表示吸水量乘以10，即1.0ml/g的吸水量 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P） 羟丙酰基交联葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20） 亲脂性，可在有机溶剂中进行分离的分子筛,操作过程： 将凝胶在适当的溶液中浸泡 (多为洗脱剂) 除LH-20外，均在H2O中进行 待充分膨胀后装入层析柱 用洗脱液洗脱 收集、回收溶液，干燥 洗脱

38、溶剂的选择 分离中性物质: 水及电解质溶液 (酸、碱、盐溶液及缓冲液) 阻滞较大的组分: 水+有机溶液 (MeOH, EtOH, 丙酮) LH-20可用有机溶液进行溶胀 (如：CHCl3、丁醇、二氧六环等) 适用：有机物质的分离,7、制备性区域电泳,装柱 水+玻璃粉胶状物 冷却夹层 电泳缓冲液：0.05M硼砂/水 电泳 上端+，下端- 1.22V/cm, 3035 mA 512 hr 处理：推出、切割、洗脱、检测,三、糖的提取分离实例,地黄根中单糖和低聚糖的分离 鲜地黄根热EtOH、H2O提 阴阳离子交换树脂 (除酸碱成分)得中性成分 活性炭柱 (15%HOAc处理) H2O、5、10、15、

39、25%EtOH 顺次洗脱 PC检定，合并 产物：D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、蔗糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖(四糖)、毛蕊糖(五糖),第6节糖的结构测定,单糖、低聚糖 多糖,一、糖的鉴定 (单糖、低聚糖),PC TLC GC HPLC ILC,1、PC,展开系统：常用水饱和的有机溶剂展开。 正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW 水饱和苯酚等溶剂系统 显色剂 邻苯二甲酸+苯胺 (使还原糖显棕黑色) 硝酸银试剂 (使还原糖显棕黑色) 三苯四氮唑盐试剂（单糖和还原性低聚糖呈红色） 3,5-二羟基甲苯盐酸试剂（酮糖呈红色）,2、TLC,(0.03M硼酸液 + 无机盐) + 硅胶 制板 常用的无

40、机盐 0.02M硼酸盐缓冲液 0.3M磷酸氢二钠或磷酸二氢钠 0.02M乙酸钠 0.1M亚硫酸氢钠 特点 增加糖在固定相中的溶解度 使硅胶薄层吸附能力下降，利于斑点集中 可增加样品的承载量 显色剂 除纸层析应用的以外 H2SO4/H2O或乙醇液 茴香醛-硫酸试剂 苯胺-二苯胺磷酸试剂,3、GC,将糖制备成三甲基硅醚 增加其挥发性 醛糖 NaBH4还原成多元醇（避免形成端基异构体） 制成乙酰化物或三氟乙酰化物,4、HPLC,填充材料 化学修饰的硅胶，如-NH2柱 Sugar D 特点 不必制备成衍生物 适合分析对热不稳定、不挥发的低聚糖、多糖 分析单糖和低聚糖，灵敏度不及GC,5、离子交换层析,

41、糖的硼酸络合物: 可进行离子交换层析 不必制成衍生物 直接用水溶液进行分离 糖自动分析仪 显色：3,5-二羟基甲苯-浓硫酸 波长：425nm 上样量：每种组成不超过1mg 洗脱剂：四硼酸钾的缓冲溶液,二、单糖绝对构型确定,对映异构体的分离原则 衍生化，引入新的手性中心非对映体 色谱柱具备手性 方法 GC HPLC 手性色谱法: 昂贵 旋光检测器：仪器昂贵 旋光比较法：样品用量大,1、GC,单糖+手性试剂非对映体化TMS化 方法 D，L-单糖与单一构型的手性试剂(L-)反应 1种单糖与2个手性试剂(D，L-)反应,2、HPLC,手性试剂： (S)-(-)-1-苯基乙基胺 样品用量少 灵敏度没有G

42、C高,二、糖链结构的测定 (多糖),纯度 MW 单糖的鉴定 单糖绝对构型的测定 单糖之间连接位置的决定 糖链连接顺序的决定 苷键构型、氧环的决定,1、纯度的测定,纯度 不同于小分子化合物 相似链长的平均分布 方法 超离心法 HPCE 凝胶色谱法, 柱h:d40 旋光测定法：不同浓度乙醇，比较 官能团摩尔比法、RI、HPLC法等,2、MW,传统方法 物理方法：沉降法、光散射法、粘度法、渗透压法、超滤过法、超离心法 凝胶柱色谱法 MS ESI-MS：单或多电荷质子 MALDI-TOF-MS MALDI (基质辅助激光解析电离)：激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子

43、，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程 多为单电荷质子!,3、单糖的组成,全水解 PC 显色确定：单糖的种类 TLCS：大致定量 GLC 多糖：MeOH解TMS化 以甘露醇或肌醇为内标，用已知单糖作标准 HPLC,5、单糖之间连接位置的决定,多糖：全甲基化水解GC定性和定量 水解 先用90%HCOOH水解，再用0.05M H2SO4或CF3COOH水解 MeOH解：有时会造成糖连接位点的甲基化，少用! 甲基化单糖中游离-OH的部位就是连接位置 低聚糖 1H-NMR：全乙酰化2D-NMR 13C-NMR测定：苷化位移,6、糖链连接顺序的决定,缓和水解法 将

44、多糖链水解成较小的片段，然后分析这些低聚糖的连接顺序 13C-NMR：弛豫时间T1 外侧糖较大 同一个糖基本相同 质谱分析：FAB-MS 2D-NMR,重点回顾,重点回顾,掌握常见几种单糖的结构 (Haworth式) 掌握化学反应的特点及应用 掌握苷键裂解的各种方法及其特点 如：酸解、碱解、酶解、Smith降解等 1H-NMR及13C-NMR在糖苷中的应用 苷键构型的测定 化学位移值大致区间 糖端基碳的化学位移值 利用J值判断苷键构型 苷化位移（含酚苷和酯苷）,糖的构型构象,反应,Molish 反应 样品 + 浓H2SO4 + -萘酚 棕色环 酸水解反应 反应难易 苷原子的电子云密度 质子化位阻 环张力 (稳定性) 反应方式 酸水水解法 两相水解法 温和酸水解 盐酸甲醇水解,端基质子的J值与构型,J值确定糖端基的构型 2-H处于a键的糖 68 Hz: H1处于a键 24 Hz: H1处于e键 2-H处于e键的糖,苷化位移 (glycosidation shift),定义 糖苷化后 端基碳 多向低场移动 酯苷：稍向高场! 醇苷元 -C：向低场移动 -C：多向高场移动 酚、酯苷元 -C：向高场移动 -C：稍向低场移动 其余碳的影响不大 这种苷化前后的化学变化，称苷化位移,