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1、分子标记技术,Molecular Marker Technology,分子标记技术课程安排,一、分子标记技术概述 (3) 二、DNA的提取、PCR优化与克隆 (3) 三、显性分子标记技术 (ISSR、AFLP) (6) 四、共显性分子标记技术(RFLP、SSR) (6) 五、分子标记数据的读取方法与分析 (3) 六、序列测定与分析 (3) 文献讨论 (6-12),周延清(编著). 2005. DNA分子标记技术在植物研究中的应用. 北京：化学工业出版社 郑成木主编. 2003. 植物分子标记原理与方法. 长沙：湖南科学技术出版社 邹喻苹,葛颂,王晓东等.2001.系统与进化植物学中的分子标记.
2、北京:科学出版社 Caetano-Anolles G & Gresshoff P M (eds) . 1998. DNA Markers: Protocols, Applications, and Overviews. New York: Wiley-Vch Press. 王中仁. 1996. 植物等位酶分析. 北京：科学出版社,参 考 资 料,一、分子标记技术概述,遗传标记 (genetic markers),形态标记 (morphological markers) 细胞学标记 (cytological markers) 生物化学标记 (biochemical markers) 分子标记 (
3、molecular markers),形态标记,Color: yellow vs white etc Texture: smooth vs rough etc Shape: round vs irregular etc,遗传标记原用于遗传作图，确定染色体上基因顺序（gene mapping） 1913年，Alfred H. Sturtevant 使用六个形态标记构建了第一个果蝇遗传图谱 1923年，Karl Sex发现菜豆数量性状（种子颜色和大小）和数量性状位点之间的遗传连锁 （QTL）,细胞学标记,核型分析 (karyotype analysis),染色体显带 (chromosome ban
4、ding),生物化学标记,同工酶(isozyme)：电泳所可区分的同一种酶（系统）的不同变化,等位酶(allozyme)：由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同,分子标记,或蛋白质序列（大小） (狭义的) 指基于DNA分子序列的标记,(广义的) 指可遗传的、且可检测到的DNA序列,是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记,分子标记是能反映生物个体或种群间基因组中某些差异特征的DNA片段,分子标记（molecular marker）技术产生的原因：（形态性状的局限） 基于形态的遗传标记（形态标记）发展到同工酶又到DNA分子标记 DNA分子标记在分子生物学的发
5、展过程中诞生和发展，它能够直接反映基因组DNA间的差异,* DNA或cDNA等分子水平上的多态性检测技术 * 能提供分子标记的分子生物学技术,分子标记技术,First Generation: 1980s -Based on DNA-DNA hybridizations, such as RFLP. Second Generation: 1990s -Based on PCR: Using random primers: RAPD, DAF, ISSR. Using specific primers: SSR, SCAR, STS -Based on PCR and restriction cu
6、tting: AFLP, CAPs. Third Generation: recently -Based on DNA point mutations (SNP), can be detected by SSCP, DNA chip, sequencing etc. 酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）,Molecular Markers Classes,1974年，Grozdicker等人首创了DNA分子标记，即第一代DNA分子标记：限制性片段长度多态性标记 （RFLP） 1982年，Hamande发现了第二代DNA分子标
7、记：简单序列重复标记（SSR） 1990年，Williams和Welsh等发现了随机扩增多态性DNA标记（RAPD） 1993年，Zebeau和Vos发明了扩增片段长度多态性标记（AFLP） 1994年，Zeitkiewicz等等发明了简单重复见序列标签（ISSR） 1998年，第三代DNA分子标记SNP诞生 随后，大量的分子标记技术被发展了起来,宏观,微观,个体,分子标记的特点,对理想的遗传标记的要求： 具有高的多态性 共显性遗传（鉴别二倍体中杂合和纯合基因型） 能够明确辨别等位基因 分布于整个基因组中 选择中性（即无基因多效性） 检测手段简单快速（如实验程序易自动化） 开发成本和使用成本尽
8、量低廉 在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）,DNA分子标记的特点,直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到 不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题 数量极多，遍布整个基因组，可检测的基因座位几乎是无限的 多态性极高，自然界存在许多等位变异，无需人为创造 表现为中性，不影响目标形状的表达 许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体,DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现 基于DNA分子标记的分子标记技术大致可分为五大类,分子标记技术的类型,1）以Southern杂交为基础的分子标记技术 限制性内切酶片断长度多态性标记（restriction fragm
9、ent length polymorphism, RFLP） 单链构象多态性RFLP（sing strand conformation polymorphism-RFLP, SSCP-RFLP） 变性梯度凝胶电泳RFLP（denaturing gradient gel electrophoresis-RFLP，DDGCE-RFLP） 原位杂交（in situ hybridization）,RFLP原理示意图,DNA 的提取,基因组DNA的酶解,琼脂糖凝胶电泳,数据分析,Southern印迹转移,标记探针杂交,放射自显影,2）以PCR为基础的分子标记,随机扩增多态性DNA（randomly am
10、plified polymorphic DNA, RAPD） 序列标记位点（sequence tagged site, STS） 序列特征化扩增区域（sequence characterized amplified region, SCAR）技术 随机引物PCR（random primer-PCR, RP-PCR） 任意引物PCR（arbitrary primer-PCR, AP-PCR） 寡核苷酸引物PCR（oligo primer-PCR, OP-PCR） 单链构象多态性PCR（single strand conformation polymorphism-PCR, SSCP-PCR）,什
11、么是STSs：即序列位置标签（Sequence Tagged Site）是指一小段DNA片段（200500个碱基对），它的精确位置和碱基顺序已经明确的。由于每个STS都是唯一的，一对唯一的PCR引物对应一个STS，通过PCR反应中也可以检测出STS来，STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。ETS是cDNA上的STS。 NCBI建有STS数据库，既可以查询STS,也可以提交，url: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/dbSTS/index.html Definition in English: Short tagged trac
12、ts of DNA sequence (200 to 500 base pairs) that is operationally unique and has a single occurrence in the human genome. Their location and base sequence are known and therefore they can be used as landmarks in genome mapping. They can be detected by the polymerase chain reaction in the presence of
13、all other genomic sequences). Sequence-tagged sites are useful for mapping the sequence data reported from different laboratories and provide a framework for the physical map of the human genome. The overwhelming advantage of sequence-tagged sites over mapping landmarks defined through other methods
14、 is that the method can be completely described as information in a database. Expressed sequence tags are sequence tagged sites derived from cDNAs.,网络资料,小寡核苷酸DNA分析（small oligo DNA analysis, SODA） DNA扩增指纹技术（DNA amplification fingerprinting, DAF） 扩增片断长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）
15、 相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism, SRAP） 靶位区域扩增多态性（target region amplified polymorphism, TRAP） 插入/缺失多态性（insertion/deletion polymorphism, InDel 或I/D）,RAPD 原理示意图,DNA提取,选择随机引物,PCR反应,凝胶电泳,图谱分析,RAPD,AFLP,3）以重复顺序为基础的标记技术,卫星DNA（satellite DNA）：碱基对的重复单位为几百至几千 微卫星DNA（microsatellite DNA）：重复单位为
16、25个碱基对 小卫星DNA（minisatellite DNA）：重复单位大于5个碱基对 简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism, SSLP） 短重复序列（short repeat sequence, SRS） 串珠式重复序列（tandem repeat sequence, TRS）,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,GA,PCR,A,B,C,SSR,ISSR（inter-simple sequence rep
17、eat）,-CACACACACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACACACACA-,5锚定引物,5锚定引物,NNNN(CA)n,NNNN(CA)n,NN(CA)n,NN(CA)n,3锚定引物,3锚定引物,-,-,3锚定引物的PCR产物,CACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACA,5锚定引物的PCR
18、产物,简单重复序列间区,4）以 mRNA为基础的分子标记技术,差异显示（differential display, DD） 逆转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR） http:/ 差异显示逆转录PCR（differential display reverse transcription PCR, DDRT-PCR） 特征性分析（representative difference analysis, RAD） 表达顺序标签（expressed sequence taqs, EST） 序列标位（ sequence tagged sites, STS） 基因
19、表达系列分析技术（serial analysis of gene expression, SAGE）,cDNA 文库,EST,RACE,公共数据库,全长cDNA克隆,电脑克隆,基因表达谱分析,5）以 单核苷酸多态性为基础的分子标记技术,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）,DNA分子标记多态性的产生有其分子的基础 生物个体在DNA水平上的差异（或多态）是DNA分子标记能进行检测和分析的基础,DNA分子标记多态性的原理,Point Mutation at restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR p
20、rimer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR) B. Insertion or deletion between restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR primer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR) C. Changes in the number of repeat unit between restriction sites or PCR primer sites: SSR, VNTR, ISSR D. Mutations at single nucleotide
21、s: SNP,Polymorphism of DNA Markers,根据DNA标记产生的方式也可以对所有标记进行简单的归类：,Comparison among genetic markers,DNA分子标记技术具有诸多优点广泛应用： 植物分子遗传图谱的构建 植物遗传多样性分析与种质鉴定 重要的农艺性状基因定位与图位克隆 转基因植物鉴定和分子标记辅助选择育种 取得惊人的成绩，具有广阔的应用前景,成 绩 考 核,精读1或多篇用分子标记技术探索某一科学问题的有影响的文章，写一篇评述。题目自拟，制成A3正反面海报(相当于A4纸， 4页), 字号自定。,内容包括： 作者（如Fritsch et al.
22、)、年份、文章标题，期刊、卷、起止页码 摘要,研究背景 （1）相关研究进展 （2）科学问题是什么？ 研究方法 使用何种分子标记技术？是否结合其他方法？ 研究结果与分析 简明扼要，文字以5段左右为宜，要求能说明问题的图表，并附详细解释。 结论/讨论 得出什么结论/新发现/意义何在？,7. 文章的影响 （如哪些引用？如何引用？） 8.文章涉及的方法对于你所在实验室（研究方向、即将开展的课题）有何借鉴意义？ 9.谈谈你对该（类）分子标记技术优缺点的理解。 如有可能，说说作者选择该（类）分子标记技术进行相关研究的优势是什么。,请附原文 打算获得A 和B+的同学要求进行15-20 min Presentation PK 平时成绩 20%，期末成绩80%(其中Presentation 10%）经常缺课不请假将影响最终成绩评定!,Thanks for your attention!,