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1、第8章 层析分离,知识点：色层分离法的分类及其概念，柱层析技术，吸附层析技术，离交层析技术，生物亲和层析技术，分配层析技术，凝胶过滤技术，电泳技术，薄板层析技术。 重点：上述各技术的原理、操作方式、操作过程、所用装置和材料的选择、适用范围，能够灵活熟练地运用这些技术。 难点：常用层析法的分类及其合理选用。,目 录,1 层析法概述 2 柱层析 3 纸层析 4 薄层层析 5 吸附层析,6 分配层析 7 凝胶过滤 8 电泳法 9 毛细管电泳 10高效液相色谱,1 层析法概述,1.1 引言 1.2 层析的发展史 1.3 层析的基本原理及基本概念 1.4 层析的分类 1.5 层析剂,1.1 引言,层析原
2、理 色谱（层析）法应用范围 色谱技术的提出,色谱分离图示,1.2 层析的发展史,1.3 层析基本概念,层析 展开（development） 洗脱液(eluate) 色谱(Chromatograph)。 分配系数 洗脱体积： 外体积： 内体积 ： 正相层析： 反相层析：,1.4 层析分类,吸附色谱与其它色谱法的异同点,1.4 层析的分类,根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,凝胶过滤法,分配层析法,离子交换色层分离法,吸附层析法,疏水作用色层分离法,金属螯合色层分离法,共价作用色层分离法, 根据实验技术的分类,低压层析技术,中压层析技术,高压层析技术,电泳法,操作压力在0.5MPa-5M
3、Pa之间,操作压力在5Mpa-40MPa之间,操作压力小于0.5MPa,靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离, 根据固定相的形状不同的分类：,柱层析法,纸层析法,薄层层析法, 根据流动相的物态不同的分类,汽相层析法,液相层析法,液相层析法, 操作方式不同的分类,迎头法,顶替法,洗脱分析法,1.5 层析剂种类,氧化铝 硅胶 活性炭 琼脂糖 纤维素,2 柱层析法,柱色谱法对色谱介质材料的要求 常用柱色谱介质的分类 柱层析系统的组成 柱色谱洗脱方法,常用柱色谱介质的分类,无机物色谱介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。 聚合物色谱介质有：琼脂糖、
4、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等。,柱色谱洗脱方法,洗脱一般有三种方法： 恒定洗脱法： 逐次洗脱法： 梯度洗脱法： 梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。,浓度梯度制造器,柱色谱系统的组成,色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成(图2)。,柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成： A 蠕动泵 B 层析柱 C 装柱 D 加试样 E 洗脱 F 检测器 G 部分收集器,柱层析系统的组成,柱层析装置图,3 纸层析法,3.1 基本原理 3.2 操作方法 3.3 操作步骤,小实验,当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4
5、种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情,可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。,1,2,3,4,这就是纸层析法。 对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。,1,2,3,4,甘氨酸,半胱氨酸,组氨酸,缬氨酸,纸层析小实验动画演示,滤纸的选用,4 薄层层析法,4.1 薄层层析原理 4.2 吸附剂及展开剂 4.3 特殊薄层 4.4 薄层层析操作要点 4.5 定性分析 4.6 定量分析 4.7 薄层层析应用,4.4 薄层层析操作要点,铺板 点样 点样量 展开 显色
6、注：本部分以操作要点注意事项为主，具体过程参见咖啡因的分离分析（动画演示）,Do you understand?,薄层层析应用示例 咖啡因的分离分析 （动画演示）,图1 芍药甙薄层层析扫描图 图2 丹皮酚薄层层析扫描图,5 吸附层析法,5.1 吸附层析定义及原理 5.2 吸附色层与其他色层分离法的异同点 5.3 吸附层析的分类 5.4 无机吸附色层分离法 5.5 疏水作用层析（HIC） 5.6 金属螯合层析 5.7 共价作用层析法 5.8 离子交换层析法 5.9 卡那霉素A、B组分分离纯化典型实例,吸附色层与其他色层分离法的异同点,吸附层析的分类,无机材料的吸附色层分离法 离子交换色层分离法
7、疏水作用色层分离法 共价作用色层分离法 金属螯合作用色层分离法等,作业,名词解释：梯度洗脱法、共价作用层析、免疫亲和层析、层析剂的排阻效应、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤： 2.填 空： 1) 凝胶过滤主要应用于，和。凝胶过滤时先自柱中流出，凝胶电泳中运动速度更快，凝胶电泳是基于和双重机理，常用的凝胶剂有和。 2) 共价作用层析主要依靠的原理，吸附层析是基于的机理，蛋白质和离子交换剂的结合是通过而结合，离子交换层析剂有和sephadex G-15 表示，硅胶G不能用显色剂检测，硅胶GH254可用于分离而无需显色处理。 3.是非判断题： 请对以下论述进行是非判断，对的打，错的打，并予以改正。 1) 凝胶电泳和凝胶过滤的机理是一样的。 2) sephadex G-15 表示水滞留量为1.5克/克干胶。 3) 硅胶G能用浓硫酸显色剂检测。 4) 凝胶过滤常用的凝胶剂有葡聚糖和琼脂糖两种。 5) 梯度洗脱法能减轻层析时的脱尾现象。,