抗生素微生物检定法.ppt

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1、抗生素微生物检定法 HPLC 紫外分光光度法 化学滴定法 效价测定 SH SL TH TL 前 言 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典 的抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立 至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着 HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种 的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下 原因： 前 言 o 微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素 药品的抗菌活性； o 多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的 差异，化学测定结果难以准确表征组分组成 、含量和生物活性间的关系； o 许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当 的化学分析方法表征其活性。 所以抗生素微生物检定法

2、目前在各国药典中仍 占有重要地位，且短期内化学分析法不可能取 代微生物检定法。 1定义抗生素微生物检定法 o 抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度 下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生 素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效 成分效力的方法。 1定义抗生素 青霉素 “抗生素是微生物在代谢中产生的具有抑制它种微生 物生长活动、甚至杀灭他种微生物的化学物质”。 “是在低微浓度即可对某些生物的生命活性有特异抑 制作用的微生物次级代谢产物及其衍生物 ” “抗生素是生物（包括微生物、植物、动物在内）在其生命 活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法衍生的），能 在低微浓度下有选择地抑制或影响它

3、种生物机能的化学物质 的总称。” 由生物发酵改为化学合成（氯霉素）、全新结构的全合成抗生素（氨曲南） 抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现 、化学改造推 动半合成抗生素的迅速发展 定义为 1942年，链霉素的发现者Waksman定义： 1929 年Flemming发现第一种抗生素（ ） 1.定义抗菌活性 o 抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生 物的能力。 o 抗生素的抗菌活性通常用效价单位来表示。 o 在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地 反映抗生素的医疗价值。 硫酸链霉素 798单位/毫克 青霉素G钠 1670单位/毫克 杆菌肽 74单位/毫克 1.定义抗生素效价定义 o “活性”重量单

4、位 o 重量折算单位 o 特定单位 1.定义抗生素效价定义 l “活性”重量单位：以抗生素中所含特定的抗 菌（抗肿瘤细胞、抗病毒）活性部分的重量 作为效价单位。 o 如碱性抗生素，以纯碱的量作为有效部分的 量；酸性抗生素，以纯酸的量作为有效部分 的量。 1.定义抗生素效价定义 o 在抗生素的生产、研究和应用等方面，均以 抗生素活性成分的“活性”重量计量抗生素的 效价单位，采用活性成分的“活性”重量1g 1效价单位的方法表示。 o 抗生素效价以“单位（u）”或“微克（g ）” 表示。 1.定义抗生素效价定义 例：硫酸链霉素 o 抗菌活性是以链霉素效价单位表示的，其链 霉素的效价单位是以具活性成分

5、链霉素碱的 “活性”重量表示的，即1链霉素效价单位1 微克链霉素碱，这里是“活性微克”而不是“重 量微克”。 1.定义抗生素效价定义 o 在制成盐类或其他衍生物后，其相应的折算 效价，可以从分子量折算而得。 o 如：硫酸链霉素的折算效价为 1.定义抗生素效价定义 l 重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某 一重量为1单位而加以折算。 o 如：青霉素G钠 以青霉素单位也称牛津单位（Oxford unit ）表示其抗菌活性，最初的定义为“1个青霉 素效价单位（u）为能在50毫升肉汤培养基 中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的 最小青霉素剂量”。 1.定义抗生素效价定义 o 例：青霉素国际标准品

6、第一批青霉素国际标准品，青霉素G钠称重 0.6微克为1单位，即1667单位/毫克。 第二批青霉素国际标准品，青霉素G钠称重 0.5988微克为1单位，即1670单位/毫克。 1.定义抗生素效价定义 l 特定单位：这一类抗生素大都组成成分较复 杂，或还不易得到纯品，在开始生产及临床 使用时，只能以一特定量的标准品（或对照 品）作为1单位。 o 如：杆菌肽国际标准品 第一批杆菌肽国际标准品为55单位/毫克； 第二批杆菌肽国际标准品为74单位/毫克。 1.定义抗生素微生物检定法 o 抗生素微生物检定法可分为： （1）稀释法 （2）比浊法 （3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法） 各国药典通常采用后两种方法

7、测定抗生素的效价。 1.定义稀释法 o 通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗 生素液体培养基中的生长情况，观察含不同 浓度抗生素的液体培养基中有无细菌的生长 ，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的 方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方 面。 1 2 3 4 5 6 7 8 一 一 一 一 一 一 一 一 不同浓度的 抗生素液体培养基 浓 稀 等量的试验菌菌液 1.定义比浊法 o 通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗 生素液体培养基中的生长情况，利用分光光 度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基 的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法， 可用于抗生素药物的含量（效价）测定。 1.定义（琼脂

8、）扩散法 o 通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试 验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所产 生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的 方法，多用于抗生素药物的含量（效价）测 定。 抗生素微生物检定方法比较： 1.定义管碟法 l 此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数 剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设 计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用， 比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计 算出供试品的效价。 TH TL SH SL 2.原理抑菌圈的形成 o 两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基 内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生 长作用。 o 当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互 动作用达

9、到动态平衡时，琼脂培养基中便形 成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素 浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制， 此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗 生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。 2.原理量反应平行线原理 o 量反应平行线原理：“在属量反应的指标中 ，当对数剂量和反应呈直线关系，且供试品 和标准品的作用性质相同时，供试品和标准 品的两条对数剂量和反应关系直线相互平行 ”。 2.原理量反应平行线原理 o 在抗生素微生物检定法中，一定剂量范围内 ，抗生素对数剂量与其所致抑菌圈的大小呈 直线关系。这就在理论上决定了，（活性） 成分相同的标准品与供试品在一定剂量范围 内产生的两条剂量反应直线

10、相互平行，符合 量反应平行线原理的基本要求。 2.原理量反应直线 o 两位微生物学者Hamphrey Light和Brown推 导出的琼脂球面扩散动力学公式： o 该方程奠定了管碟法量反应直线公式的基础 。 o 将上述公式简化、移行，并将自然对数转 换为常用对数得： o 上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM)与 所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直线关系 ，即通过抑菌圈的大小来测定抗生素抗菌 活性物质的量。 3.检定方法 o 分类 一剂量法（标准曲线法） 二剂量法（2 2法） 三剂量法（3 3法） o 二剂量法（2 2法）：用标准品、供试品各两个 剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下

11、 ，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。 二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定； 3.1管碟法的操作步骤 3.1管碟法的操作步骤 预试验试验准备 双碟底层的制备 供试品、标准品溶液的制备菌层的制备 滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈的 测量结果的可靠性检验及效价测定 3.1管碟法的操作步骤 o 预试验： 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使 用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈 的大小符合规定：高剂量浓度溶液所致的抑 菌圈直径在1822mm。高剂量与低剂量 的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的抑 菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。 3.1

12、管碟法的操作步骤 o 试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌 ；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲 液的准备、半无菌间的紫外消毒等。 3.1管碟法的操作步骤 o 双碟底层的制 备： 每只双碟加底 层培养基约 20ml，待培养 基凝固，待用 。 3.1管碟法的操作步骤 o 供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供试 品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品 、标准品相关剂量的溶液。 3.1管碟法的操作步骤 o 菌层的制备： 菌层培养基：在培养基 中添加一定量的菌悬液 ，振摇混匀。注意菌层 培养基温度；根据预试 验确定加入菌层培养基 的菌液量。 每只双碟加入5m

13、l菌层 培养基。 注意制备菌层的速度和 平整度。 3.1管碟法的操作步骤 o 滴加抗生素溶液： 注意标准品、供试品高、低剂量 溶液滴加顺序，保证滴加速度和加 量的均匀一致。每组双碟至少为8 个，一般为10个。 在每个双碟的4个钢管中，对角的 两个钢管分别滴加高浓度和低浓度 的标准品溶液，其余两个对角位置 的钢管分别滴加相应的高、低浓度 的供试品溶液。 按SHTHSLTL顺序，分别 滴加标准品和供试品高、低剂量溶 液。 3.1管碟法的操作步骤 o 双碟的培养： 根据培养温度 的要求在培养 箱中进行培养 ，培养箱中水 平叠放的双碟 数以不超过三 层为宜。 3.1管碟法的操作步骤 o 抑菌圈的测量：

14、 将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管 倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内 浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或不 圆整圈应将碟弃去，切忌主观挑选抑菌圈和 双碟，是结果造成偏离。 抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在相 同的测量参数下进行测量。 手工测量：游标卡尺 3.1管碟法的操作步骤 o 结果的可靠性检验及效价测定： 抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果 。 3.1管碟法的操作步骤 培养后的双碟 3.1结果计算及判断 o 可靠性检验 抗生素微生物检定法前提条件是：标准品S 和供试品T各对数剂量与反应呈直线关系， 且标准品S和供试品T的两条直线平行。 可靠性测验是利用生物统计方法

15、验证标准品 和供试品的量反应关系是否显著偏离直线、 偏离平行。对在一定概率水平下不显著偏离 直线、不显著偏离平行的实验结果，认为可 靠，所得检定结果有意义。 3.1结果计算及判断 o 以红霉素眼膏为例，红霉素标示量为0.5%， 即每1g红霉素眼膏中含5000u红霉素。假设 投料量为100%，那么估计效价为100%。试 验采用二剂量法；剂间比为2；浓度比为1； 试验菌为短小芽孢杆菌CMCC（B）63 202 。 3.1结果计算及判断 可靠性测验计算： p结论：回归非常显著F27.82（P0.01）(即不显著偏离 直线）；偏离平行不显著F34.26（P0.05）；实验结果 成立。 试品间 F1=

16、0.5326 P=0.05 F= 4.2600 回 归 F2= 873.2370 P=0.01 F= 7.8200 偏离平行F3= 0.2537 P=0.05 F= 4.2600 P0.05 剂 间 F6= 291.3411 P=0.01 F= 4.7200 碟 间 F7= 2.1653 P=0.01 F= 3.6700 回归（F2） 表示测验的量反应值是否随剂量而有规律的增加或降低。 回归项变异（P0.05）不显著，则平行关系是可靠的。 3.1结果计算及判断 抑菌圈测量值： = 碟号 ds1 ds2 dt1 dt2 ym - No.1 18.13 19.24 18.09 19.63 75.0

17、9 No.2 17.85 19.41 17.96 19.60 74.82 No.3 18.14 19.55 18.09 19.89 75.67 No.4 18.05 19.83 18.10 19.75 75.73 No.5 18.07 19.98 18.21 19.70 75.96 No.6 18.15 19.37 17.88 19.52 74.92 No.7 18.19 19.46 17.97 19.63 75.25 No.8 17.93 19.85 18.06 19.94 75.78 No.9 18.09 20.04 18.35 19.67 76.15 - yk 162.60 176.73

18、 162.71 177.33 679.37 - 3.1结果计算及判断 效价计算： 碟数 m= 9 圈数 K= 4 估计效价 At=100% 剂间比 r= 2.0000 浓度比 D= 1.0000 对数值 I= 0.3010 t表 t= 2.0640 样品方差 S2= 0.0263 自由度 f=24 R的对数 M= 0.0074 回归系数 g= 0.0049 标准误差 Sm= 0.0102 对数比值 R= 1.0173 R上限 Rh= 1.0680 R下限 Rl= 0.9691 测定效价 Pt=101.7265% Pt上限 Ph=1067.9584 下限 Pl= 969.1406 平均可信限率P

19、t的FL%=4.86% PT的可信限FL和平均可信限率FL% 可信限FL和平均可信限率FL%是反映检定结果精密度的统计量。 PT的可信限是PT标准误差SM和t值（在95%的概率水平下）的乘积。 可信限范围（PT tSM）表示对该供试品进行100次检验，95次的结果在PT tSM PTtSM范围里。 PT平均可信限率FL%： FL%= (tSM)/PT 100% 中国药典中，一般抗生素微生物检定平均可信限率限定在5%范围内，个别品 种放宽至7%。 3.1结果计算及判断 o 重试判定 抑菌圈大小的要求 可靠性检验： 符合可靠性检验各项规定后，才能认为 试验结果可靠，方可进行效价和可信限率计算。 可

20、信限率： 供试品效价测定结果（PT）的可信限率除 特殊规定外，不得大于5%。 实测效价与估计效价： 试验计算所得效价应在估计效 价的10%以内，即：试验所得效价低于估计效价的 90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试 ，应调整供试品估计效价，予以重试。 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍复试。 o 标准曲线法（一剂量法）： 将标准品一组剂量的对数与微生物的反应绘 制成直线图，相同条件下，测得供试品对微生 物的反应值，在标准品的标准曲线上查出引起 该反应的抗生素的相对浓度及效力。 一剂量法一般用于制备标准曲线或测定血药浓 度。 3.2一剂量法 操作步骤标准曲线法 o 中心点浓度C0

21、的选取 中心点的抑菌圈直径应 在1617.5mm。 剂距 按等比级数选取。 一般采用1:0.8、 1:0.88、1:0.85。 C0 C0 C0C C C 操作步骤标准曲线法 o 分组 按选取的C0及剂距，一般分为 8个组，即溶液浓度为C1、 C2C8。 每组双碟数应不少于3个，一 般可用5个，个别情况可增至 10个。 C0 C0 C0 C C C 操作步骤标准曲线法 o 点样 每个双碟安置6枚钢管。 在各组每个双碟6枚钢管相间隔的三个钢管内， 均滴加C0标准液。 在第一组每个双碟的其余三个钢管内滴加C1的 溶液，在第二组每个双碟的其余三个钢管内滴 加C2的溶液 滴加药液的顺序，可从中心浓度组

22、开始向高、 低两端交叉滴加。如8个稀释度的双碟，滴加次 序可为C4、C5、C3、C6、C2、C7、C1及C8。 C0 C0 C0C C C 操作步骤标准曲线法 o 抑菌圈的测量 双碟在规定温度下培养一定时间后，采用抑 菌圈测量仪测量每组试验双碟抑菌圈的直径 。 o 结果计算及可靠性检验 以抑菌圈直径为横坐标，以浓度的对数为纵 坐标，绘制标准曲线。 经计算得到回归直线方程 相关系数：1r0.99 3.3检定方法 o 三剂量法（3 3法）：用标准品、供试品各三个 剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下 ，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。 三剂量法用于抗生素药品的仲裁或标准品的标定

23、。 操作步骤三剂量法 o基本要点 中剂量点的抑菌圈直径应在 1518mm。 三个剂量之比为1:0.8（1.25:1）。 o点样 每组双碟至少为9个，一般为15个。 在每个双碟的6个钢管中，互相间隔的3个钢管分别滴加高、中、低浓 度的标准品溶液，其余3个钢管内分别滴加相应的高、中、低浓度的供 试品溶液。 按SHTHSMTMSLTL或THSHTMSMTLSL顺序 ，分别滴加标准品和供试品高、中、低剂量溶液。 操作步骤三剂量法 o 三剂量法双碟、钢管与抑菌圈位置图 S3：标准品高剂量 S2：标准品中剂量 S1：标准品低剂量 T3：供试品高剂量 T2：供试品中剂量 T1：供试品低剂量 操作步骤三剂量法

24、 o 抑菌圈的测量 双碟在规定温度下培养一定时间后，采用抑 菌圈测量仪测量每组试验双碟抑菌圈的直径 。 o 结果计算及可靠性检验 4.实例及操作要点 o 硫酸庆大霉素 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法实验条件 o 培养基：培养基I（pH7.88.0） o 试验菌：短小芽孢杆菌CMCC(B)63 202 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法实验条件 o 缓冲液：pH7.8磷酸盐缓冲液 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使 成1000ml，滤过，在115灭菌30分钟。 K2HPO43H2O 5.59/174.18（174.18+3 18）=7.32 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法实验条件 o 双

25、碟的制备：将双碟置于水平面上，加底层 培养基20ml，待凝固后，加菌层培养基 5ml，凝固后备用。菌层培养基中菌悬液的 量约为培养基量的2%。加菌悬液的量可视 抑菌圈大小及清晰程度进行调节。 称样量的计算 o 按标准品的标识效价、供试品的标识量或估计效 价计算称样量： 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤 ： o 标准品溶液的制备： o 假设：硫酸庆大霉素标准品的效价为636 单位/mg，理论计算应精密称取78.62mg ，置50ml量瓶（636单位 /mg78.62mg50000单位）中，恰好 为1000单位，但实际操作中一般称量数接 近即可，如精密称取标准品80.10mg。 中国药典硫酸庆

26、大霉素二剂量法操作步骤： o 80.10mg 水 50ml 制成1018.87单位 /ml o 精密量取5ml buffer 50ml 制成101.887单 位/ml o 精密量取5ml buffer 50ml 制成10.189单 位/ml o 精密量取5ml buffer 100ml 制成5.094单 位/ml 庆大霉素 212单位/ml 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤： p 供试品溶液的制备（原料）： 根据硫酸庆大霉素原料的估计效价计算供试品 的称样量。 假设：供试品的估计效价为590单位/mg，则 称样量为50000/590=84.74mg，但实际取样 量为84.24mg，第一步称

27、样置50ml量瓶中， 实际 估计效价为 80.10mg636u/mg/84.24mg604.7436 单位/mg。 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤： o 84.24mg 水 50ml o 精密量取5ml buffer 50ml o 精密量取5ml buffer 50ml o 精密量取5ml buffer 100ml 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤： o 供试品溶液的制备（制剂） o 片剂：取本品10片，精密称定，研细，精密称 取适量（根据平均片重及标示量折算，约相当 于庆大霉素0.1g）,如为糖衣片，取5片，全部 研细，加灭菌水振摇使硫酸庆大霉素溶解，并 稀释成每1ml中约含100

28、0单位的悬浮液，摇匀 ，静置，取上清液适量，照硫酸庆大霉素项下 测定方法测定。 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤： o 平均片重为0.1357g o 规格为40mg(4万单位) o 暂估计其标示量为95% o 第一步需制成1000单位/ml溶液，拟取供试品10 万单位为： 1000000.1357g/(4000095%)=0.3618g， 实际称取0.3702g，则实际估计标示量为： 中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤： o 用钢管放置器或适宜方法等距离均匀放置不锈钢小管，并静置5 10分钟，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再滴加抗生素溶液。 o 每次以5个双碟为一“小分队”滴加药液。 o

29、滴加溶液：按SHTHSLTL顺序，分别滴加标准品和供试品 高、低剂量溶液。可以使高低剂量的抑菌圈直径差异显著，从而提 高检定灵敏度。 o 培养温度和时间：培养温度为3537，培养时间为1416h。 o 结果计算：测定抑菌圈，进行可靠性检验，计算效价，可靠性检查 若能通过，且可信限率不超过7%，则试验数据有效。如果所测得 的效价结果低于估计效价的90%或高于110%时，则检验结果只 作为初试，应调整供试品估计效价，重新试验。 o 平均可信限率不大于7%的品种 红霉素、琥乙红霉素、依托红霉素 克拉霉素 硫酸西索米星 硫酸奈替米星 硫酸依替米星 硫酸庆大霉素 硫酸小诺霉素 操作要点 o 第一步一般应

30、制成500或1000单位/毫升的溶 液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，每步稀 释的量取量以不少于2ml为宜，稀释步骤应少 于3步。 o 溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时 所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充 分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温 后再稀释至刻度。 操作要点 o 培养基的pH值，对试验结果影响很大，使用时培 养基的pH值应调节到适合该品种试验的最佳范围 。通常灭菌后的pH值范围为7.88.0或6.56.6 。对碱性抗生素而言，在偏碱性条件下它的抗菌活 力强，如氨基糖苷类的链霉素在pH值7.8以上时活 力强，抑菌圈清晰，当抑菌圈偏小时，可考虑把培 养基的

31、pH值适当调高至8.0或更高些。对酸性或两 性抗生素，在酸性条件下它的抗菌作用强，使用 pH值6.56.6培养基为合适。通常灭菌后pH值会 下降0.2左右，因此pH值应略高0.20.4。调节 时要注意逐渐加碱，防止过量，否则再加盐酸矫正 ，将会增加培养基的含盐量，从而降低培养基的使 用效果。 操作要点 o 试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应 保持菌种及菌液的新鲜。 o 一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变 异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行 单菌分离；其他菌株可半年分离一次。 o 试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变 异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65 加热

32、30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色 ，应有芽孢85%以上。 操作要点 o 加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不 大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的 体积过小，则在同样实验中，不同次加入菌悬液 的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬 液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因 菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养 基结块，影响测定结果。对于加入菌悬液体积的 控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。 操作要点 o 在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培 养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气 泡。 o 加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为 65，对非芽孢悬液时，菌层培养基的

33、温 度一般为4850。 o 放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避 免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌 圈大小不一。 5.检定的影响因素 o 标准品与供试品的同质性 o 抑菌圈质量的控制 o 直线斜率的控制 o 直线截距的控制 5. 影响因素标准品与供试品同质 o 抗生素效价测定方法依据的原理是量反应平 行线原理，即标准品与供试品剂量的反应直 线是相互平行的。如不平行，则斜率不等， 计算结果将产生较大的误差。 5. 影响因素标准品与供试品同质 o多组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌活性（增强或拮抗） 物质的量与供试品有所不同，则可使量反应直线不平行。 o用于标准品、供试品溶液制备的缓

34、冲溶液pH、盐浓度不相同。 o供试品中所含有的如维生素、氨基酸、无机盐或其他生长物质，而标准品 中没有，在营养条件低的培养基上即会产生影响。 o某些对光敏感的多烯类抗生素在标准品、供试品溶液配制，及试验过程中 应注意避免光线直射。 o有差向异构特性的抗生素在测定时，尤其注意pH、盐浓度、温度和光照 对抗生素差向化的影响，保证标准品与供试品在相同条件下进行测定，以 消除影响。（如四环素在1mol/L磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液中，pH3.2（ 23）时可形成55%差向四环素异构体，它的活性相当于四环素的5% ，造成二者反应直线不平行） 5. 影响因素标准品与供试品同质 o “乙酰吉他霉素”是以“吉他霉

35、素”来表征其抗菌活性 的，日抗基有收载，效价测定时以“吉他霉素”为标 准品，将“乙酰吉他霉素”水解24小时后再进行测定 。在测定时曾发现测定结果的误差较大，重现性差 。采用HPLC法对乙酰吉他霉素水解后的组分进行 测定，以考察其是否水解为吉他霉素。 乙酰吉他霉素 乙酰吉他霉素水解24小时 吉他霉素组分 o 结果显示，乙酰吉他霉素经24小时水解后并未转 变为吉他霉素，并与乙酰吉他霉素的成分也不同 ，提示采用吉他霉素为标准品测定乙酰吉他霉素 效价时，吉他霉素标准品与乙酰吉他霉素水解后 的样品的成分不同，易引起实验误差。 o 根据量反应平行线原理，标准品与供试品的同质 性，改用乙酰吉他霉素为标准品，

36、将标准品与供 试品同时水解后测定，减小了误差。 水解条件的修订 o 琥乙红霉素 水解条件由： （CP2000） （CP2005） p 依托红霉素 （CP2000） （CP2005） （CP2010） 室温2h 室温16h或406h 室温2h 376h 604h 5.影响因素抑菌圈质量的控制 o抑菌圈的形状 o抑菌圈大小的控制 o抑菌圈边缘清晰度的控制 5.影响因素抑菌圈质量的控制 o 抑菌圈的形状：实验中抑菌圈常多有破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的： 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢管壁使抗生素溶 液漏出，抑菌圈出现不圆； 双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染（如庆

37、大霉素、平 阳霉素等容易吸附在钢管、玻璃仪器的表面），出现细菌不生长 ，或者有多余的抑菌圈产生，或者抑菌圈非正常的变大； 试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温度过高，将检定 菌烫死等，会导致细菌不生长； 稀释抗生素溶液所用缓冲液的pH值和盐浓度也可影响抑菌圈的圆 整，如氨基糖苷类抗生素，当缓冲液的pH值偏低、盐浓度偏高时 ，会出现无抑菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。 5.影响因素抑菌圈质量的控制 o 抑菌圈大小的控制 M=C0V 当抗生素浓度C0不变时，体积V（即加样量）的对数与抑 菌圈直径或面积呈直线关系，故钢管中滴加抗生素的体积 应一致。钢管（截面积A，高度L）的大小（重量、直径、 高

38、度）应严格控制。 5.影响因素抑菌圈质量的控制 o 抑菌圈大小的控制 抑菌圈大小受T值（抗生素扩散时间，即细菌刚生长 到显示抑菌圈所需的时间）增减的影响，故预先延长 抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。 o 操作中若各钢管中加液时间不同，差值为t，则 T变成T t，此时可影响抑菌圈的大小不均一 ，所以一组双碟加样时，应尽量缩短加样间隔时 间，并保持加样速度的均匀性，以减少误差。 o 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数D的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。 5.影响因素抑菌圈质量的控制 o 抑菌圈边缘清晰度的控制 抑菌圈边缘

39、清晰度是影响测定结果的重要因素之一，导致抑菌圈 边缘不清晰的原因有多种： 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均一，不符合动 力学公式中各项之间的关系或各扩散系统交叉所致。 如试验菌种放置时间过长，菌群中个体的生长周期不同，对抗生 素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成双圈或多圈，使边缘模糊不 清。 培养基原材料的成分及质量、pH值、盐浓度及培养时间均可影响 抑菌圈边缘的清晰度。 多组分抗生素中，各组分抗菌活性的不同，扩散系数也不同，其 交叉作用影响抑菌圈边缘的清晰度。 5.影响因素斜率的控制 o 由公式中斜率（ ） 来推算： 反应直线的斜率愈小愈好，因为斜率越小，直线越平稳，抗生 素效价的微

40、弱差别，可导致抑菌圈大小的差别较大，使测定结 果更精确。 如扩散快，即扩散系数D值大，则斜率小；如细菌生长慢，时 间长，T值大，则斜率小。 如扩散系数D值不变，T值变小，则试验菌生长快，时间短， 斜率就大，这样生物反应的灵敏度低，重现性差。为使T值增 大，可在滴加药液后，在室温放置约1小时，再置孵箱培养。 5.影响因素直线截距的影响 o 相同浓度的抗生素，截距小的抑菌圈大，效价测定的灵敏度高。 截距的大小取决于 数值，除温度、扩散系数和抗 生素最低抑菌浓度对截距有影响外，培养基厚度H也是影响因素 之一。培养基厚度越薄，截距减小，抑菌圈增大，所以在制备双 碟时，应保持在相同的试验组内，每只双碟中

41、底层和菌层培养基 的厚度应保持一致性和均匀性。 管碟法特点 o优点： 基本操作和设计适用于各种抗生素，试验 结果较稳定； 样品用量少，灵敏度高； 适合于大批样品的测定。 管碟法特点 o缺点: 凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果； 试验过程长，需第二天才有结果； 操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的 结果； 受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量 ，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效 价强度。 0个（cp2000) 1个（cp2005） 22个（cp2010) 比浊法 比浊法 1. 定义 2. 基本原理 3. 应用举例 4. 操作步骤 5. 注意事项 6. 检定的影响因素 7. 比浊法的特

42、点和仪器 1.比浊法的定义 o 中国药典2005年版的定义： 本法系利用抗生素在液体培养基中对 试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细 菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试 验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的 一种方法。 2.检定原理 o 基本原理：细菌接种于澄清的营养丰富的液 体培养基中，在一定的温度下培养一段时间 ，变浑浊，其浑浊程度与细菌数的增加、细 菌群体质量的增加和细菌群体细胞容积的增 大之间存在着直接的关系。当一定的光束照 射其已经浑浊的液体培养基时，通过测定其 透过率就知道细菌生长情况，在一定的抗生 素浓度范围内，剂量响应为一直线。因此， 在剂量响应曲线的直线范围内，可设计

43、比浊 法测定抗生素含量。 2.检定原理 o细菌的群体生长期的选择： 细菌的群体生长的整个变化过程大致可划分为如下 阶段或时期：（A）诱导期（延滞期）（B）对数 生长期（C）稳定期（D）死亡期 2.检定原理 o (A)诱导期（延滞期）： 本阶段为增殖准备期，细胞处于适应时期，本阶 段时间的长短受多种因素的影响。当培养基营养 丰富，新鲜，培养条件适宜，接种的培养物又具 有很强的活力时，时间将会缩短，反之，则时间延长。本阶 段内各种酶合成旺盛，体积增大。 o (B)对数生长期： 在诱导期后，细胞经过适应、恢复，在提供足够的营养物质 条件下，细胞数呈对数生长速率，此时，细菌细胞数的增长 率是细胞数、基

44、质的浓度与抑菌物质浓度三者的函数。在对 数生长期中细胞数的增长率一般是一个常数。 2.检定原理 o （C）稳定期： 本阶段细胞增长率逐步下降到零，一部分 细胞繁殖、生长，另一部分细胞死亡，趋 于平衡。 o （D）死亡期： 细菌细胞的死亡率超过增长率，细胞总数开 始减少，主要是营养物质的缺乏、代谢产物 的毒性、自溶酶的产生而导致细菌细胞溶解 或死亡。 2.检定原理 o测定时间的选择 剂量反应平稳生长时间段： 一定抗生素浓度范围内，检定菌在单位时间内的生长速度相同，即生长 速率相同，也就是在一段时间内反应培养时间(A-t)呈显著的直线关 系，且在不同抗生素浓度下的生长速率也相同。 3.应用举例 中

45、国药典2005版比浊法品种： 硫酸庆大霉素的效价测定 抗生素试验菌培养基灭菌缓 冲液pH 值 抗生素 浓度范 围单位 /ml 培养 类别条件 编号pH值温度/ 庆大霉 素 金黄色 葡萄球 CMCC (B)2600 3 III7.07.27.80.151. 0 3537 中国药典2005年版硫酸庆大霉素的效价测定： o （1）试验菌液的配制：取金黄色 葡萄球菌CMCC(B)26003的营养 琼脂斜面培养物，接种于营养琼 脂斜面上，在3537培养20 22小时后，用0.9%灭菌氯化钠溶 液洗下菌苔，并用0.9%灭菌氯化 钠溶液稀释，使其在650nm波长处 的吸收值为1.0。 o （2）含试验菌的液

46、体培养基配制 ：取试验菌液1.5ml置100mlpH7.0 7.2培养基III中，摇匀，备用。 临用前，取规定的试验菌 悬液适量（ 3537培养 34小时后测定的吸光度 在0.3 0.7之间，且剂距 为2的相邻剂量间的吸光度 差值不小于0.1），加入到 各规定的液体培养基中， 混合。 使在实验条件下能得到满 意的剂量-反应关系和适宜 的测定浊度。 已接试验菌的液体培养基 应立即使用。 中国药典2005年版硫酸庆大霉素的效价测定： o （3）缓冲液：pH7.8磷酸盐缓冲液 中国药典2005年版硫酸庆大霉素的效价测定： 阳性对照：取1支试管，加入灭菌水1.0ml，再 加入含试验菌的液体培养基9.0ml。 阴性对照（空白对照）：取1支试管，加入灭 菌水1.0ml，再加入含试验菌的液体培养基 9.0ml，立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为 吸光度测定的空白液。 中国药典2005年版硫酸庆大霉素的效价测定 ： o（4）效价测定： o供试品溶液的配制：取庆大霉素制剂适量，精密称定，按标示 量用灭菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液适量，用 pH7.8磷酸盐缓冲液稀释成0.4和0.8u/ml(1:2)的溶液。 o标准品溶液的配制：取庆大霉素标准品适量，精密称定，用灭 菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液适量，用pH7.8磷 酸盐缓冲液稀