高效液相色谱讲义.ppt

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1、第七章 高效液相色谱法,第一节 概述,一、史程、专用术语,二、色谱分离过程和类型,液固吸附色谱,液液分配色谱,离子交换色谱,离子对色谱,空间排阻色谱,三、色谱流程和仪器,四、HPLC的特点,速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用,第二节 基本理论,一、色谱分离过程,（一）液-固吸附色谱,流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸 附作用的不同来分离物质。,流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液 色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间 的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一 种是涂渍于载体上的固定相。,（二）液-液分配色谱,流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相 分配色谱法,

2、流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相 分配色谱法,（三）离子交换色谱,（四）离子对色谱法,（五）分子排阻色谱法,二、色谱流出曲线和保留值,（一）色谱流出曲线及相关术语,（二）保留值,三、分离度,第三节 定性和定量分析,一、定性分析,（一）利用已知物对照法定性,1、利用保留特性,2、利用不同柱比较,（二）色谱法和其他方法结合定性,1、利用化学反应定性,2、利用二极管陈列检测器,3、收集峰的流出物,4、HPLC-MS,二、定量分析,（一）峰面积或峰高的测量方法,1、手测峰高,2、峰高乘半峰宽,3、剪纸称重,4、积分仪测定,5、微处理机测定,（二）定量方法,1、峰面积归一法,2、外标法,3

3、、内标法,4、内加法（或追加法）,第四节 高效液相色谱的分离模式,一、基本原理,二、分类,1、吸附色谱,2、分配色谱,3、离子交换色谱,4、分子排阻色谱,5、亲和色谱,三、HPLC在生物大分子中的应用,在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离 子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离 模式。,第五节 液-固色谱法,液-固色谱法通常称为吸附色谱,1、载体：硅胶,2、吸附剂吸附试样的能力,3、原理,第六节 键合相色谱法,一、正相色谱法,1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团 都是极性基团。,2、分离机制属于分配色谱,3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是 用来分离不同类型的化合物。,二、反

4、相色谱,1、分离机理,2、固定相,3、流动相,第七节 离子交换色谱,离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相， 树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团， 当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时， 组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交 换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。 按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子 交换树脂和阴离子交换树脂。,种类,阳离子交换树脂,强酸性,弱酸性,阴离子交换树脂,强碱性,弱碱性,离子交换层析适用性,能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。,使用离子交换剂使物质分离

5、表 样品 强酸型(磺酸型) 稀NH4OH洗脱 通过液 酸性、中性化合物 解离型、两性化合物 稀NaOH洗脱 强碱型(季铵型) 强碱型 稀HCl洗脱 通过液 通过液 酸性化合物 中性化合物 解离型物质 两性化合物 (盐、生物碱),一、离子交换色谱的分离机理,1、,不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时 溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置 换反应的重要因素。,2、,P0：流动相中溶质的浓度,Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度,D0：流动相中洗脱剂的浓度,Db：填料表面上洗脱剂的浓度,Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的 洗脱剂的数目。, Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数, 在

6、Z值不能忽略时,在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K与保留 体积成比例，同时洗脱过程中，Kd， Db是常数， 用Kz表示。,3 结论,二、离子交换色谱的固定相,1、高分子类型填料, 优点,a填料的使用寿命长,b具有较高的色谱容量,c 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性 有利。, 结构,以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时 也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。, 类型,Mono Beads,TSK-gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW,2、无机基质型,三、离子交换色谱的流动相,1、流动相的PH值, 离子交换容量受流动相的PH值影响, 改变流动相PH值，也会影响弱电离

7、的酸 性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的 保留值。,流动相PH值的变化也能改变分离的选择性, 对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液 来实现。,2、流动相的离子强度,四、离子交换色谱的影响因素,1、填料孔径的影响,2、柱长的影响,3、流速的影响,4、PH值的影响,无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质 均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保 留选择性、分离度和回收率等因素。,5、离子强度的影响,第八节 体积排阻色谱法,一、分离机理,1、体积排阻色谱法（SEC） 或空间排阻色谱法（SEC） 或凝胶色谱法,2、凝胶过滤色谱法（GFC）,Sephadex 葡聚糖凝胶,3、凝胶渗透色谱法（G

8、PC）,4、空间排斥理论,V0 死体积，相当于凝胶的粒间体积,Vs 色谱柱中凝胶的孔穴总体积,二、体积排阻色谱法的特点,三、体积排阻色谱法的固定相,（一）固定相的分类,1、按固定相基质分类,2、按固定相机械强度分类,（二）凝胶固定相的特性参数,1、渗透极限,2、分离范围,3、固流相比,在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为 固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为 流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积 的比值称作固流相比。,4、柱效,（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点,物理因素影响凝胶色谱柱的性能, 扩大分离范围使用两根以上的串联色谱 柱。,更换流动相,谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不

9、同分子量 聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。, 在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加 而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增 大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度 保持不变。, 在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。,四、体积排租色谱法的流动相,在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值 和分离选择性无影响。, 溶解样品的良溶剂, 低黏度溶剂, 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀, 控制流动相的PH值和离子强度, 凝胶渗透色谱示差折光检测器 流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率 有较大的差别。 凝胶过滤色谱紫外吸收检测器 使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。,（一）凝胶渗透

10、色谱的流动相,凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等 有机溶剂作流动相。,在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中， 四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好 的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。,（二）凝胶过滤色谱的流动相,在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同 PH值的多种缓冲溶液作流动相。,五、体积排租色谱的影响因素,1、填料, 化学键合的硅胶, 亲水树脂凝胶,2、柱长,体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。,3、洗脱液, 以硅胶为基质的填料，PH值范围在2.0-8.0。, 键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时 保留时间主要取决于填料表面上的

11、硅醇基与离 子的反应。,a) 洗脱液离子强度低时,b) 洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/L,c) 常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节,d) 用氯化钠作离子剂，疏水作用最小,e) PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱,4、流速,蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很 重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比 较理想。,5、样品容量,进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的 分离度。,样品的浓度范围一般在0.01%-0.5%.,最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得 到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积 的1%-3%比较合适。,6、蛋白质在变性条件下的分离, 变性溶剂如6m

12、ol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1% 十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白 质的分子量。, 在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到 低分子量范围内。,示例：用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组 人肿瘤坏死因子(rh-TNF)衍生物的相对分子量,rh-TNF属基因工程药物，其相对分子量的测定 是该药质量控制的主要指标之一。,仪器与色谱条件：岛津LC-10A HPLC 色谱柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000 (30cm7.5cm) 流动相 0.1mmol/L KH2PO4 :0.1mmol/L Na2SO4(1 : 1) + 0.05% NaN3,

13、流速: 1mL/min 检测波长:280nm,标准蛋白相对分子量曲线的制备： 选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐 酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等 因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既 在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内 标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填 料孔的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系 数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有 良好的重现性。,样品测定: 根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd，由Kd 从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr， 计算相对分子质量。,第九节 亲合色谱法,亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专 一性作用，从复杂

14、生物样品中分离和分析特 殊物质的一种色谱方法。,亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键 形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择 性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统 亲合色谱的专一性与HPLC的快速，稳定，检测 方便等优点结合起来。,一、亲合色谱分离机理,亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体 的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。,亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合 复合物形成及其解离的过程。,载体,L,X,配基,待分离物质,通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的 组分洗脱下来：,a) 如果亲合复合物的亲合力不强,b) 当配基与被分离组分的亲合力较强,c) 非常紧密地结合在

15、固定相配基上的物质洗脱,配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合 复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低， 也不宜太高。太低专一性太差，太高则洗脱困难。,R：结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力,K：复合物的离解常数,L：固定化配基的浓度,二、亲合色谱的固定相,亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生 物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如 果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基， 就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基 相对应的物质。,1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶交联聚 苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性 等树脂。,优点,具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性，

16、 广泛的PH值的适应性,对于生物大分子样品都有较好的相溶性。,填料容易合成,2、无机基质,多孔硅胶,可控孔径玻璃,3、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱 的特点,可以提高效率，还可以改善回收产物纯度和 浓度,检测灵敏度得以大幅度提高,具有更高的选择性,配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并 提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化 工作是非常有利。,三、亲合色谱影响因素,1、平衡和平衡缓冲溶液,选择平衡缓冲溶液所具有的PH值，离子强度， 温度和化学组成都应使配体与蛋白质之间能发 生比较强的相互作用。,2、蛋白质的浓度和温度效应,对亲合力一般或较高的蛋白质，其互补酶的浓 度对亲合容量的影响不

17、明显，柱顶端结合的大分 子与最初加入的大分子浓度无关。,温度效应在亲合色谱中非常重要，因为亲合 填料吸附作用的强度随温度升高而降低。,3、特异性洗脱,通常选用对纯化的活性分子有高的亲合力，但 其结构与填料上的配体不同的配体来洗脱，这 样就保证了吸附和洗脱双重特异性，使非特异 性洗脱减少到最小程度。,4、非特异性洗脱,非特异性洗脱主要受缓冲溶液中的PH值，离子 强度，温度和介电常数的控制。,第十节 色谱分离方法的选择,一、相对分子量,分子量2000，凝胶色谱柱,分子量2000，但同时分子量相差10%， 凝胶色谱柱,分子量2000的水溶性电解质，酸性物质用 阴离子交换树脂，碱性物质用阳离子交换树脂,分子量2000的水溶性非电解质，选用反相 色谱法,分子量2000的非水溶性物质，弱极性物质 选用反相色谱法，极性物质选用正相色谱法。,二、溶解度,三、化学结构,