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1、人体呼出气标记物,The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin, China Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin, China 150001. ,Harbin Medical University,李 恩有 Enyou Li, M.D., Ph.D Professor and Chairman,Harbin Medical University,哈医大
2、创立人 伍连德 博士,伍连德博士：Cambridge University 在厦门建立了中国第二个海关检疫所 1910年12月东北发生鼠疫大流行，到哈尔滨防治。 1915年建立中华医学会，任书记并兼任中华医学杂志 总编辑。 1916年当选为中华医学会会长，并兼任公共卫生部委员。 1918年任北洋政府中央防疫处处长、北京中央医院（今位于白塔寺的北京医科大学人民医院分院）院长。 1926年创办哈尔滨医学专门学校（哈尔滨医科大学前身），任第一任校长。 伍连德还是中华医学会的创建人之一和第二、三任会长，他主持创办了20多所医院或医学院校,郑方教授的学术思想的继承与发扬,郑方 教授,1979年 气相色谱
3、技术研究吸入麻醉药 1980年 麻醉机与呼吸机物理性能测定 1990年 全紧闭吸入麻醉技术 计算机自动控制麻醉技术 在郑方教授指导下开始 1995年 七氟烷分解产物及麻醉机环路内 微量气体的分析 2003年 由国外PHILIPS文章知道VOC概念 调入哈医大一院 2004年 开始摸索人体呼出气的分析技术 2005年 获得国家自然科学基金 2006年 建立了气质连用微量气体分析技术 2007年 呼出气戊烷作为标记物与缺血再关 注损伤、丙泊酚呼出气成分的分析 2008年 芬太尼呼出气成分的测定 2009年 丙泊酚呼出气快速分析仪、 人体呼出气标记物的机制,麻醉领域的研究现状,德国的慕尼黑大学 （4
4、篇） 2006年 日本的防卫医科大学 （1篇） 2007年 中国哈尔滨医科大学附属一院（4篇） 2009年,2003年-2009年 SCI收录文章9篇,我们发表的论文,Simultaneous analysis of microsatellite instability and loss of heterozygosity by capillary electrophoresis with a homemade kitJ Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life(IF 2.5)2006,834(1-2):122-127 The effects of ben
5、zodiazepines on orexinergic systems in rat cerebrocortical slices. Anesthesia and Analgesia 2007 ;104(2): Determination of fentanyl in human breath by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry Microchemical Journal (IF 2.505) 2009;91:149-152 Breath pentane: an indicator fo
6、r early and continuously monitoring lipid peroxidation in hepatic ischemia-reperfusion injury European Journal of Anaesthesiology 2009;6(26):153-159 Breath Analysis of Intravenous Fentanyl in the Anaesthetized Patients: a Feasibility Study. Journal of International Medical Research 2009 Investigatio
7、n of propofol concentrations in human exhaled gas by Solid-phase microextraction-Gas chromatography-Mass spectrometry. Journal of International Medical Research 2009,VOC的研究,2005年国家自然科学基金 2006年分析方法的研究 2007年戊烷与全肝缺血再灌注损伤的研究 Propofol 呼出气分析的方法学研究 Fentanyl呼出气分析的方法学研究 2008年世界麻醉大会(WCA)1篇 2008年欧洲麻醉学年会(ESA)1篇
8、 2008年美国麻醉学年会(ASA)3篇,2008 ASA Annual Meeting in Orlando, Florida.,“Fentanyl analysis of human breath in semi-closed circuit by gas chromatography-mass spectrometry“ “Breath pentane increased before death account for total hepatic ischemia-reperfusion injury in swine“ “Application of SPME and GC-MS t
9、o determine propofol in end-exhaled breath samples and venous plasma“,WCA 2008,气相色谱质谱分析,A Day in the Life of Oscar the Cat David M. Dosa, M.D., M.P.H.,Volume 357:328-329 July 26, 2007 Number 4,诊断疾病的狗,糖尿病：调查发现，其中65%的患者出现血糖过低症状时，他们养的宠物狗都会有所反应，通过哀鸣、吠叫、舔舐或者其他行为来警告主人。 狗的嗅觉灵敏，这些“人类最好的朋友”早就被用于帮助探查毒品或者爆炸物。
10、通过训练，这些狗能够嗅出细微到占空气万亿分之一的异常气味，非常非常细微。它们的世界与我们所能嗅到的完全不同。” 模仿狗鼻制造电子鼻 “癌症与生物探测狗研究中心”由外科医生约翰亨特于5年前成立。当时伦敦阿默莎姆医院的科学家证实，狗可以通过嗅闻尿液分辨病人是否患有膀胱癌。 1989年，英国伦敦的两位皮肤病学家在英国著名医学杂志柳叶刀上描述了一个有趣的病例：一名44岁的女子患者要求切除她腿上的一颗痣，因为她的狗总是凑到她的腿上嗅闻这颗痣，甚至试图咬掉这颗痣。 这颗痣是一种致命性皮肤癌。由于发现得早，这名女子保住了性命。,呼出气的标记物,呼出气是人体代谢的产物 含量极其微量（PPB以下） 特殊的分析技
11、术 探讨其诊断意义,呼出气体的分析反映人体生物化学过程,古希腊医生从病人呼出的特异性气味诊断疾病。 1970年代, Pauling 等用气相色谱测定出了在人类呼吸中有200多种挥发性有机复合物。 1970-1980年代，呼出气体分析存在的主要问题是复合物的分离和鉴定。 1980-1990年代，由于分析技术的发展，对挥发性物质与生理过程及疾病的相关性的研究越来越多。 呼吸分析的临床应用是我们现在和未来的挑战目标。,人类呼出气VOCs,在人类呼出气中已有500多种VOCs被检测到，其中大多数为内源性。 通常用于诊断目的的有烃类：乙烷、戊烷和异戊二烯；含氧化合物：丙酮、乙醛、甲醇、乙醇和2-丙醇；
12、含硫化合物：二甲硫醚、甲基硫醇、乙基硫醇、二硫化碳； 含氮化合物：氨、二甲胺、三甲胺。,人类呼出气分析：疾病的生物标记物,在挥发性有机化合物（VOCs）的浓度模式和某些疾病的发生之间有关联 。 现在的分析仪器能够监测到人类呼吸气中正常和异常浓度的复合物。 病人呼出气的组成，例如肺癌，肺炎症性疾病，肝或肾功能不全，糖尿病，包含有价值的信息。 对氧化应激的监测和定量，在术中基于对呼出气的组成来对氧化应激进行监测，已经取得了很大的进步。,呼出气与疾病,呼吸气中丙酮的甜味常伴随着没有控制的糖尿病，肝脏疾病有 鱼腥味，肾衰有尿味。(Di Francesco et al., 2005; Libardoni
13、 et al.,2006) 现代呼吸分析始于20世纪70年代，Linus 用气相色谱在人类呼 出气中检测出了200种不同的挥发性有机化合物（VOCs）。 最近的30年，有很多这些化合物被鉴定出来。 呼出气中有很多痕量的VOCs，例如丙酮，甲醇或异戊二烯(Miekisch et al., 2004; Zolotov, 2005)， 甚至少量的无机分子，如氧化亚氮(Dweik,2005),一氧化碳(Kharitonov and Barnes, 2001)或羰基硫化物(Studer et al., 2001)。,呼出气的主要成分是氮、氧、二氧化碳、水和惰性气体，有一小部分痕量有机复合物，浓度范围在n
14、mol/lpmol/l（ppbv-pptv）。到目前已被测出有500多种，这些挥发性物质可能是机体产生，也可能是由于环境污染。 外源性卤代有机物已在人体中测出，且证明其在环境中摄取，从体内清除3。为监测机体疾病过程，必须测定内源性复合物。这些内源性复合物包括无机气体：NO、CO；有机复合物：乙烷、戊烷、丙酮、异戊二烯； 能在呼出冷凝物中测定的非挥发性物质：以前列烷、过氧化亚硝酸盐及细胞因子。 在最近二十年NO作为许多生理过程及炎症的标记物已被公认，呼出气中的NO已能被商业化的有效设备测定。,呼出气分析是血液和尿液检查的方便和安全的补充手段(Abbott et al., 2003; Amann
15、and Smith, 2005)。与传统的诊断方法相比呼吸分析有很多优点。它是无创的，无痛的，不需要经训练的医疗人员采样(Spinhirne et al., 2003)。 尽管有3000多种化合物可以在不同的人中检测到(Phillips et al., 1999a,b)，呼吸气的基质比血液和其它体液还是不复杂的。这使得呼吸分析易于实施(Prado et al.,2003; Libardoni et al., 2006)。尽管有很多明显的优点，但是还没有作为标准工具引入到临床诊断中。 呼吸分析的常规应用是在饮酒后测量乙醇和乙醛（后者作为乙醇的代谢产物）的浓度(Mitsubayashi et al
16、., 2005)。 13C-尿素或氨呼吸分析是诊断幽门螺杆菌感染对敏感和特异的技术，而氧化亚氮用来诊断哮喘(Ochiai et al., 2001)。,“肺泡气”采集 “直视呼气末二氧化碳曲线法”采集呼出气,临床麻醉和呼出气采集方法,2002年受中国科学院大连化学物理研究所许国旺老师启发。 （呼出气与代谢组学） 呼出气成分能够体现不同的生理过程及疾病状态，通过一系列呼出挥发性标记物能识别和诊断复杂疾病。 糖尿病人-丙酮 肝功衰竭病人-含硫化合物 胆固醇代谢障碍-异戊二烯 脂质过氧化-乙烷和戊烷 跨学科领域-将分析化学与医学有机结合,Miekisch W, Clinica Chimica Act
17、a.2004,呼出气中的挥发性有机物以血液为媒介，能够体现机体的病理生理过程，能识别和诊断疾病，呼出气中的戊烷能反映机体细胞脂质过氧化程度。 氧自由基及其介导的脂质过氧化反应在肝缺血再灌注损伤的发生、发展中起主要作用，脂质过氧化反应产物MDA 、SOD的研究已很多，但脂质过氧化的呼出气标记物-戊烷国内尚无人研究。,Kohlmuller D , Anal Biochem. 1993 Risby TH , Free Radic Biol Med. 1999,Every Breath You Take, Well Be Watching You,Anesthesiology 2007; 106:65
18、24 Copyright 2007, the American Society of Anesthesiologists, Inc. Lippincott Williams & Wilkins, Inc.,On-line Monitoring of End-tidal Propofol Concentration in Anesthetized Patients Akira Takita, M.D.,*,Real-time Monitoring of Propofol in Expired Air in Humans Undergoing Total Intravenous Anesthesi
19、a Cyrill Hornuss, M.D.,*,Every breath you take, we ll be watching you Evan D Kharasch, Anesthesiol 2007;106:652-4,Shortly after the clinical introduction of propofol, the aroma noticeable immediately upon opening the bottle suggested a sufficiently high vapor pressure to portend pulmonary propofol e
20、limination, and hence the possibility of detecting and quantifying propofol in expired gas by the mass spectrometer then in use in the OR. A proposal to our ORs mass spectrometer manufacturer to investigate this possibility was not reviewed favorably, and the idea was soon forgotten.,丙泊酚,丙泊酚有一个酚的化学结
21、构，因此在理论上有一定的挥发性。从它特征的气味中我们明显的知道其具有挥发性，但是其沸点很高（256），因此溶液中挥发性丙泊酚的浓度是及极低的。 实时监测麻醉病人呼出气中丙泊酚浓度的技术困难是非常的大，目前还没有这样的专业设备。然而，质子转移反应质谱（PTR-MS）是相对新的仪器，它依靠质子转移与空气中痕量的VOCs发生反应，并且是实时的。,丙泊酚及其代谢产物,丙泊酚（2，6 二异丙基苯酚）是一种常用的静脉麻醉药。 利用化学电离技术从患者呼出气中实时的测到了丙泊酚及其挥发性代谢产物(2，6 二异丙基醌和2，6 二异丙基对苯二酚)。,Real-time breath monitoring of p
22、ropofol and its volatile metabolites during surgery using a novel mass spectrometric technique: a feasibility studyG. R. Harrison1,On-line Monitoring of End-tidal Propofol Concentration in Anesthetized Patients Akira Takita, M.D.,* Kenichi Masui, M.D., Ph.D., Tomiei Kazama, M.D., Ph.D.,在所有参与实验的患者中，都
23、从气呼出气中测到了挥发性的丙泊酚。 丙泊酚浓度曲线与呼吸周期几乎同步，,呼出气丙泊酚的浓度曲线与稳态血药浓度关系 呼出气浓度随着输注速率的提高而升高,呼出气浓度的波动与延迟,在推注丙泊酚之前，呼出气中没有 检测到挥发性丙泊酚。 推注丙泊酚后，所有病人的呼出气 丙泊酚都有一个明显的波动。 从time 0到检测出丙泊酚的平均时间 是41.88.0s， 从time 0 到达峰浓度的时间是333.870.0s。,分析方法,质子转移反应质谱(PTR-MS) 离子分子反应质谱ionmolecule reaction mass spectrometry （IMR-MS） SPME and GC-MS,丙泊酚
24、血浆浓度与呼气末浓度,丙泊酚是静脉麻醉药中的主要代表，目前广泛应用在各种麻醉中。丙泊酚的麻醉效能与它的效应浓度有关，依赖于血液/组织分配系数，还与其血浆浓度有关（cpPL）。 对cpPL的定量能够提供一个很好的监测和控制麻醉的有效手段。 无创、连续监测cpPL的方法还没有找到。 目前常用输注丙泊酚麻醉的操作有以下两种：即TCI靶控输注和根据BIS值来控制丙泊酚的输注速度。,呼气末丙泊酚浓度（cpA）的研究方法,分析肺泡呼气末丙泊酚浓度（cpA）可能会成为监测cpPL的无创方法。 建立动物模型，能够控制和测定麻醉剂的浓度，当麻醉剂浓度改变时呼出气和血浆中样本浓度也相应发生明显的变化； 由于丙泊酚
25、难挥发，要首先在呼出气中证实它的存在并能精确定量； 确定呼出气浓度和血浆浓度的特定关系，必须同时采集血样和气样； 肺脏参与了丙泊酚的肝外清除和代谢，必须研究丙泊酚在肺脏的代谢和分布，测混合静脉血及动脉血中丙泊酚血浆浓度； 使用可靠、简单和稳定的方法监测cpA。,细胞膜结构,吸附效率与回路内气流,回路内富集及麻醉通气系统的改造,下腔静脉置管,戊烷色谱图,GC-MS、GS-GasPro（60m0.32mm）plot 柱、Lab Solution V 2.0,血中戊烷浓度的变化,低流量60 min设为基础, P0.05, P0.01 vs 基础,Cope KA , J Appl Physiol. 2
26、004,麻醉通气系统的改造,麻醉通气系统的改造,脂质过氧化,肝功能,再灌注1 min戊烷,脂质过氧化,P450,戊烷,AST,肝功能,戊烷代谢,脂质过氧化,肝功能,戊烷,脂质过氧化的稳态监测 脂质过氧化代谢产物MDA 呼出气中的碳氢化合物乙烷和戊烷 呼出气产生后数分钟之内便能从体内呼出，呼出气标记物比血浆标记物（MDA）更敏感。,Scholpp J , Clin Chem Lab Med. 2002 Janero DR , Free Radic Biol Med. 1990,我们测到的Propofol,propofol,Clinical data of the patient：Man, 56y
27、ears, 67kg, cerebral aneurysm Exhaled air sample (5min after single dose of 60mg Propofol ),propofol,研究背景,其他静脉注射药物，如芬太尼，能否也可经呼吸道排出？,检测不同剂量芬太尼诱导的病人呼出气,常规剂量,5例病例（-）,4例病例（-） 1例病例（+）,二尖瓣狭窄; 芬太尼诱导剂量：35g/Kg,大剂量,静脉注射丙泊酚可经呼吸道排出,“呼出气”芬太尼研究概况 1.在合成芬太尼的车间中工作的工人“呼出气”中检测到芬太尼呼出气还是药物粉尘？ Van Nimmen NF, Veulemans HA
28、. J Chromatogr A. 2004;1035:249-259. 2.分别在心胸外科手术室环境、麻醉机通气回路中采集的气体样本（500mL）中检测到芬太尼来源于呼出气么 McAuliffe PF, Gold MS, Bajpai L, et al. Med Hypotheses. 2006;66:874-882.,（2）分子量：528.580 （3）理化性质：初合成时为白色结晶性粉末，易溶 于水，1g该品可溶于约40mL水，易溶于甲醇， 略溶于乙醇、氯防和乙醚。熔点为149-151， 在达到沸点之前，于300左右即快速分解。,研究背景,2、芬太尼的体内代谢经典理论 McClain DA
29、, Hug CC. Clin Pharmacol Ther. 1980;28:106-114. 是否存在其他代谢途径？,iv,肝脏及肠粘膜细胞色素P450 3A4代谢,代谢产物随尿液和胆汁排出体外,8%药物以原型经尿液和粪便排出体外,探讨芬太尼经静脉注射后，经呼出气分析的可行性 确立可行的呼出气采集、预处理与分析检测方法 对呼出气芬太尼浓度进行定量分析,3、临床麻醉 （1）开放外周静脉，桡动脉穿刺置管 （2）静脉诱导：咪唑安定1-3mg，维库溴铵 0.1mg/Kg， 芬太尼 20-30g/g，依托咪 酯0.2-0.6mg/Kg （3）气管内置管 （4）机械通气：新鲜气流量1L/min，潮气量
30、10mL/Kg, 呼吸频率12-20次/min,4、气样采集 （1）麻醉诱导前采集气样20mL （2）自静脉注射芬太尼开始计时，给药后5min ， 10min，15min，20min，25min，30min分别采 集20mL气样 （3）气样迅速注入密闭样品瓶（预先抽取真空）,临床麻醉和呼出气采集方法,Fentanyl from the Exhaled Breath may Contribute to the Occupational Exposure,（一）芬太尼保留时间 芬太尼标准溶液（0.1ng/mL）色谱图 （ QP2010 Lab Solution Software 2.0 ）,结 果
31、,（二）临床病人资料 表1.麻醉病人一般资料及芬太尼给药量,结 果,续表1,结 果,（三）呼出气芬太尼定性结果 A.麻醉诱导前空白气样色谱图；B.静脉注射芬太尼15min后病人呼出气样色谱图 （ QP2010 Lab Solution Software 2.0 ）,结 果,（五）呼出气芬太尼浓度随时间变化规律 1.同一病人不同时间点呼出气芬太尼峰面积（m/z 245）随时 间变化曲线,结 果,2.同一病人不同时间点呼出气分析色谱图,结 果,结 果,A-F分别对应各时间点的呼出气分析色谱图 （ QP2010 Lab Solution Software 2.0 ）,结 果,芬太尼在肺脏的药代动力学
32、 首过效应：单次静脉注射芬太尼后，约75%的药物被肺脏快速摄取。 Roerig DL, Kotrly KJ, Vucins EJ, et al. Anesthesiology. 1987;67:466-472. 当化合物pKa值大于8时，容易被肺脏摄取清除。芬太尼的pKa值为8.4，肺脏对其有较强摄取及排泄作用。 Boer F. Br J Anaesth. 2003;91:50-60.,讨 论,除了依靠肺血管内皮细胞内外浓度差进行被动弥散进入细胞外，肺血管内皮细胞还可以主动摄取芬太尼，也可能经此方式释放芬太尼。 Waters CM, Krejcie TC, Avram MJ. Anesthes
33、iology. 2000;93:825-831.,讨 论,本论文研究表明： 静脉注射 原型排出 动脉系统 原型排出 代谢产物排出 细胞色素P450 3A4代谢转化 芬太尼代谢示意图,讨 论,单次静脉注射芬太尼后，呼出气芬太尼浓度随时间变化，达峰时间较动脉血药物浓度“延迟”（动脉血药物浓度在30s内达峰）,讨 论,Taeger K, Weninger E, Schmelzer F, et al. Br J Anaesth. 1988;61:425-434.,讨 论,呼出气芬太尼与麻醉医生成瘾 麻醉医生成瘾现状： 来源：DEA，Office of Diversion Control,讨 论,麻醉医生成瘾表现： 镇静、意向障碍、反应迟钝、药物戒断症状等，可导致多器官功能障碍，包括神经内分泌系统、心血管系统及胃肠道系统，甚至导致死亡。 麻醉医生芬太尼成瘾率高可能与麻醉病人呼出气中芬太尼进入手术室环境导致的职业暴露有关,讨 论,谢谢！,