修改第四章植物离体快速繁殖ppt课件.ppt

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1、第四章 植物离体快速繁殖,第一节 植物快速繁殖的概述 一、植物快速繁殖的概念 植物快速繁殖就是利用细胞的全能性理论及细胞的再生特性，在组织培养条件下，加速繁殖材料的个体生产，提高繁殖系数，使其在较短的时间繁殖较多植株的方法(它是一种微型操作过程，称为微繁 )。,二、植物快速繁殖的意义 （一）有效保持植物优良品种的特性； （二）生产无病毒的种苗，防止品种退化； （三）快速繁殖新优品种，加速优良品种的推广； （四）节约耕地，节约留种成本，提高农产品的产出率； （五）便于流通与运输； （六）珍稀物种保存；,第二节 植物快速繁殖再生途径 利用植物组织培养技术进行快速繁殖时，植物的根、茎、叶、叶柄、花器

2、官、孢子等均可作为外植体进行离体培养，通过下列再生途径诱导分化产生小植株。 （一）器官途径 1. 器官型 植物的茎尖部分是分化组织区，即产生植物地上与地下部分的全能性区域。存在于叶腋间的腋芽在正常情况下均能发育成枝条。,游离细胞或原生质体,侧芽分化,诱导生根,茎尖,嫩枝,叶片茎段,直接成芽,胚状体,诱导生根,愈伤组织,芽,愈伤组织,胚状体,萌发,植 株,再 生 植 株,2. 器官发生型 器官发生型诱导途径即外植体脱分化形成愈伤组织再分化出器官的方式。将离体组织或器官在培养基上进行培养时，形成愈伤组织。将愈伤组织转移到适宜的培养基上继续培养，这些愈伤组织细胞将发生生理代谢上的改变，经分裂逐步产生

3、分生细胞团和分生组织，再进一步分化出具有根、茎、叶的完整植株，这种从愈伤组织再生出小植株的过程叫再分化。,幼根,外植体,愈伤组织,脱分化,植物体,生长点,植株,分离,幼茎,3. 原球茎型 由茎尖或腋芽培养分化成原球茎，最早是1960年法国的Morel发现虎头兰的茎尖培养中形成扁平的小球体与其种子胚发育的球茎非常相似，叫原球茎。在建兰的茎尖或侧芽培养中发现其上长出白色的圆球突起，将它切成小块又会长出绿色莲座叶状的原球茎，再切割这种原球茎成为一个无性繁殖系，将它置入植物激素仅加10%椰乳的培养基中，即可分化出茎、叶和根。,4. 球茎芽型 不同发育阶段的球茎都是茎或枝条的变态形式。由非茎尖或侧芽的外

4、植体不经脱分化的愈伤组织，直接从圆球茎分化出芽和根器官的方式叫球茎芽型。,5. 块茎型 块茎是膨大的地下茎，其表面有芽眼。当花叶芋的叶片或叶柄接种在培养基上，先形成类似愈伤组织的小硬突起，并逐渐形成粒状的芋块。随着小芋块的增大，分化出的芽也越密集并形成许多小苗，在小苗基部与芋块交接处分化出白色的根，与正常块茎切块繁殖的幼苗相同，即首先形成有分化能力的块茎（芋块），然后在块茎上分化出小芋块，再在其上分化出芽和根，最后生长发育成小植株。,6. 鳞茎型 百合的鳞茎切块接种在不同激素配比的修改的MS培养基上，鳞片基部近轴面或在边缘直接形成带根的小鳞茎。而卷丹鳞片的顶部、中部和基部均能诱导分化出小鳞茎。

5、华西贝母的二、三年生幼嫩鳞片，可不经过愈伤组织直接形成小瘤状或叶状体，再将其切块及时移入修改的ER培养基上，二、三个月后诱导出与自然界条件下生长相同的贝母鳞茎。,7. 根茎型 该途径主要应用于蕨类植物中。蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体，通过根状茎上产生的蕨叶及根，迅速发育形成再生植株。,8. 微小短枝扦插型 用微小短枝扦插在培养基上，添加外源的细胞分裂素，促使具有顶芽的或没有顶芽的休眠芽启动生长，形成微型的多枝多芽的丛状结构。经几个月，将丛生芽的一个枝条转接继代，重复芽-苗的增殖培养，从而迅速获得无数的嫩枝。,9. 孢子型 用成熟或未成熟的孢子进行培养。它包括花药培养和

6、花粉培养。花药培养属器官培养的范畴，一定发育时期的花药在适当条件下，通过胚发生途径和器官发生途径形成单倍体植株。花粉培养（及游离小孢子培养）属细胞培养的范畴，通过人工培养离体花粉或小孢子，改变其形成花粉管和精子的发育途径，诱导形成单倍体植株。,（二）胚状体发生途径 证实高等植物细胞存在全能性的最惊人事实是由培养的植物体细胞可以诱导分化形成胚状体，并随后经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚共个时期的类胚途径，发育成完整的植株。,通常产生胚状体的途径有： （1） 直接胚状体发生-从外植体的某些部位直接诱导出胚状体。 （2） 间接胚状体发生（愈伤组织分化出胚状体）-在此过程中，首先是外植体细胞感

7、受培养刺激，诱导形成愈伤组织；接着愈伤组织细胞胚性化；第三阶段是胚性细胞形成胚状体。 （3） 从悬浮培养的细胞中诱导-培养细胞在液体培养及中，先产生胚性细胞团，再形成胚状体。 （4） 由花粉产生的单倍体胚状体。 （5） 由原生质体产生胚状体。,第三节 常见问题及克服措施 污染、褐化、玻璃化是组织培养过程中的最主要问题 一、污染及控制 污染问题是植物快繁过程中常见的而且也必须给予高度重视的一个问题，许多试管苗因污染率过高而导致成本较高，经济效益不佳。一般而言，工厂化生产试管苗的污染率应控制在%以内。,(一)污染的类型 1、细菌污染 菌斑呈粘液状物，常在接种1-2天后出现。 2、真菌污染 污染部分

8、长有不同颜色的霉菌，常在接种10天左右后出现。,细 菌 污 染,真 菌 污 染,(一)污染的控制 1、材料带菌与控制。 原因：选用的外植体因过大等原因本身带有病菌，或继代培养的材料本身带有病菌。 控制方法：彻底灭菌，特别是对于有绒毛的外植体；初代接种时使用大小适宜的外植体；在继代的培养中，每次继代之前都要对继代的材料进行仔细检查，凡是污染的材料应予以丢弃或进行重新灭菌。,2、接种污染与控制。 原因： 第一是由于超净工作台滤出的空气中带菌超标造成的，属于这种情况要及时修理或更换超净工作台；第二是由于交叉污染造成的，要求接种者操作细心，接种用的镊子不要与酒精灯、台面等接触，一旦接触应立即进行消毒处

9、理，同时各瓶材料接完时要对镊子、剪刀等用具进行消毒；第三是由接种者呼吸、工作态度等原因造成的。 控制方法：要求操作人员端正工作态度，自身做到尽量少带菌，在接种时应用酒精棉擦手，穿上无菌的白大衣，带上口罩和帽子,3、培养过程感染与控制。 原因：在材料培养的过程中，环境中病菌多、湿度大、温度高。 控制方法：要经常进行清洁卫生，对培养空间定期进行消毒处理，及时清除污染材料，转移继代材料。,4、培养基的污染与控制。 原因：培养基中的细菌特别是内源菌污染是培养基污染的重要原因之一。 控制方法：在培养基中加入抑菌剂，较理想的抑菌剂是2 mg/L的庆大霉素和0.3的丙酸钠。 高压灭菌锅故障造成高压灭菌不彻底

10、，会造成大规模的污染,二、初代培养外植体的褐变及控制 褐变是组织培养过程中最常见的现象，被列为植物组织培养的三大难题之一，主要发生在初代培养阶段。外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。,固体培养中，发生褐变与未发生褐变的比较,（一）褐变的主要原因 1植物品种： （1）植物种类与品种不同，即基因型不同，其褐化的难易不同。 （2）植体体内的单宁类、色素类、多种羟酚类化合物的含量高，则容易导致褐化。 （3）一般木本较草本的易褐化，多年生的较一年生的易褐化。,*核桃的单宁含量很高，组织培养难度大；即使形成愈伤组织，还会因为褐化而死亡； *在红豆杉愈伤组织的细胞培养过

11、程中，由于多酚氧化酶被氧化为醌类物质，这些醌类物质呈现红褐色，能抑制很多代谢酶的活性，产生褐化现象，影响了植物组织的正常生长，甚至死亡。,2生理状态： 通常植物体幼龄部位采取的外植体褐化较轻，而老龄部位采取的外植体褐化较重，幼龄外植体材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。一般来说,随着年龄和组织木质化程度增加而褐变加强;外植体受伤程度也影响褐变。,3培养基成分 培养基中浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高 4培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。,（二）褐变的控制 为了提高组织培

12、养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制，以减轻褐变现象的发生。 1选择合适的外植体 对于某一特定的快速繁殖对象，一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，可以使褐变现象明显减轻。,2培养条件： （1）一般液体培养基上加滤纸桥和半固体培养基能减轻褐化。 （2）低盐培养基尤其是Mn2+、Cu2+ 浓度降低能减轻褐化。 （3）部分细胞分裂素如BA、KT等能促进酚类化合物的合成，刺激多酚氧化酶的活性，因此降低BA、KT的用量能减轻褐化。,（4）利用2,4-D和IAA可延缓多酚合成，减轻褐化的产生，但外植体在高浓度的2,4-D下培养时间过长，愈伤组织变得松软、呈水渍状，失去分化能力。 （5）降低培养基

13、中的pH值控制酚氧化酶活性和底物利用率，因为这种酶在pH=6.5时活性最强。,（6）改变氧化-还原势常用的还原剂有维生素C、柠檬酸、巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸等。使用方法可以在外植体材料消毒前快速浸入其中30秒60秒，浸泡时间不可过长，否则外植体褐变会更加严重，因为抗氧化剂对外植体有一定毒害作用；或用它们浸湿滤纸并在其上进行外植体的切割。,（7）利用吸附剂减低或清除酚类产物，如23克/L的活性碳能吸收某些酚类产物，520克/L的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）能稳定单宁。但吸附剂在吸附有毒酚类的同时，也要吸附培养基中的生长调节剂。 （8）抑制酚氧化酶的活性，常见的是利用鳌合剂鳌合铜离子降

14、低褐化，如乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙基二硫代氨基甲酸脂、二甲基二硫代氨基甲酸脂等。,（9）热激处理。利用多酚氧化酶是一种不耐热的酶，在4550以上活性迅速下降的特点，将外植体在4550高温预处理45分钟后再接种，有效地降低褐化。 （10）改变糖的用量和种类。降低培养基中蔗糖的浓度至1%可减轻褐化，同时若有些植物的外植体在蔗糖中褐化严重，可用葡萄糖或山梨糖代替以减轻褐化。,3连续转移培养 对容易褐变的材料可间隔1224小时的培养后，再转移到新的培养基上，经过连续处理710天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,三、继代培养中的玻璃化现象及控制 （一）玻璃化现象的特点 进行离体繁殖时，有些培养

15、物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。,大叶冬青,白三七,（二）玻璃化现象产生的原因及控制 玻璃化现象的产生主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的。常通过以下措施加以控制。 1优先培养的种类（或品种）和外植体:事先通过预备实验，确定用于组织培养的种类或品种，并进一步选择合适的外植体。对容易发生玻璃化的种类或品种，要尽量减少在水中的浸泡时间，做到随洗随灭，漂洗后立即接种。,2琼脂的调节:适当提高琼脂浓度，其浓度不低于0.8%，尤其是在高温季节，更应使用高纯度的、

16、固化程度好的琼脂。 3碳源的调节:增加蔗糖用量，避免采用葡萄糖作碳源。 4激素调节:适当降低细胞分裂素BA的用量，可将BA改为2-ip等其它类型的激素或进行交替使用。在继代培养中，采用附加不同种类和浓度的激素如KT，IBA等的培养基。,5湿度调节。采用通气性好的封口材料如纱布、脱脂棉、滤纸、牛皮纸、带有透气孔的薄膜等。 6温度调节。注意避免培养温度的突然升高以及避免变温培养。另外适宜温度的热击也可以消除玻璃苗，其原因可能是热击可以降低内源细胞分裂素的水平。 7光照调节。一般情况下光照1012小时，光强15002000Lux时就能够满足大多数植物的正常生长和分化。,8改变供氮形式。适当减少铵态氮

17、的量而提高硝态氮的量，同时提高培养基中的碳氮比均可减少玻璃化的比例。及时转接，以免氨积累。 9氯离子调节。适当降低培养基中的氯离子浓度，有利于减轻玻璃化的产生。,10尽量减少创伤乙烯产生。在继代过程中，严格选择生长正常、健壮的茎尖作为继代培养的材料。加快切割速度，控制接种密度，尽量减少创伤乙烯产生，并防止乙烯过剩而导致玻璃苗的形成。 11在培养基中可附加聚乙烯醇(PVA)、活性炭及青霉素G钾等，也可降低玻璃苗的产生。,四、离体快速繁殖的遗传变异及控制 遗传变异在植物的离体快速繁殖中普遍存在，但它又影响快速繁殖的效果。了解遗传变异的发生和控制方法，对快速繁殖有重要的意义。 （一）外源激素对性状的

18、影响 一般来说，外源激素在离体快速繁殖过程中容易引起植物性状的变化，因此，原则上尽可能地避免使用外源激素。,(二) 继代次数对性状的影响 当初代培养的试管苗在瓶内长满到瓶塞，或培养基养分利用完时就要转瓶-继代培养。在此过程中会产生两种现象，即驯化现象和衰退现象。 驯化现象：开始继代培养培养的材料，需要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入就可以生长的现象。,驯化现象 1、概念：植物在开始进行继代培养时需要加入生长调节物质，但随着继代次数的增加，少量加入或不加生长调节物质就能生长的现象。 2、原因：在继代培养中生长调节物质积累。 3、缺点：（如卡德利亚兰实生苗在长期加香蕉的培养基中继代） （1）

19、只长芽不长根，芽多而细弱（补加IAA，几次继代后又会长出根）。 （2）发生变异.,衰退现象：长期继代培养的材料也会逐渐衰退，丧失形态发生能力，具体表现在生长不良，再生能力和增殖率下降等。 研究结果表明，继代次数越多，植物发生变异的概率就会越大，特别是在增殖过程中，需要添加外源激素的植物。因此，无菌培养物要定期更换，同时，增殖培养时，尽可能减少继代次数。,衰退现象 1、概念：植物长期进行继代培养后，生活能力、形态发生能力、再生能力都会下降的现象。 2、原因：不详，但与下列因素有关 (1)植物种类的差异，同一植株不同器官的差异。 3、繁殖能力的差异（一般)是： 草本植物 木本植物； 被子植物 裸子

20、植物； 年幼材料 年老材料； 胚 营养体组织； 芽 胚状体 愈伤组织；,（2）培养基和培养条件影响。 由于培养基和培养条件是否适当对继代培养的影响很大；所以常常改变培养基和培养条件来保持继代培养； 例：桃茎尖在MS中，初代培养良好，继代后生长不良；转入低氨态氮、低钙，增加硝态氮、Mg+、P培养基中则能继代； 石斛茎尖或腋芽培养，在固体培养基中形成原球茎后，继代培养需要液体培养基进行振荡培养；,（3）、继代培养次数增加 继代次数对繁殖率的影响因培养材料而异； 葡萄、黑穗醋栗、月季、倒挂金钟等长期继代仍能保持原来的再生能力和繁殖率； 香蕉不定芽的变异频率： 继代5次：2.14%； 继代10次：4.2%； 继代20次：100%； 因此，香蕉继代培养不能超过1年；蝴蝶兰：连续培养4年后，植株退化不能开花；,（4）、季节 水仙鳞茎： 6、7月份休眠，生长变慢； 8月休眠后，生长加快； 百合鳞片的分化能力： 春季 秋季夏季冬季,（三）无菌培养体系增殖方式的影响 一般来说，离体快速繁殖是在保证遗传稳定性的前提下，实现较短的时间繁殖出较多的植株。而增殖方式对遗传变异的影响较大，因此，在离体快速繁殖过程中，无菌培养体系的增殖方式首选茎芽增殖，其次是不定芽增殖，不宜选择愈伤组织增殖方式。,